| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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| Detection of Poly (A) RNA in Mesophyll Cells of Nicotiana benthamiana Using in situ Hybridization
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Author:
Date:
2015-09-05
[Abstract] Export of transcribed mRNAs from nucleoplasm to cytosol is an essential process for the translation of genes into proteins. This process is tightly regulated by nuclear pores, composed of about 30 nucleoporin proteins (Nups). Whether or not the mRNAs are able to be appropriately exported to cytoplasm is of an importance for understanding the role of Nups. Here, we describe a practical protocol to detect the intracellular localization of mRNAs in mesophyll cells of Nicotiana benthamiana (N. benthamiana). This protocol is based on poly (A) in situ hybridization method using an oligo d(T) probe conjugated with Alexa Fluor-488.
[摘要] 将转录的mRNA从核质到细胞质的输出是将基因翻译成蛋白质的必要过程。 这个过程受到由约30个核蛋白（Nups）组成的核孔紧密调节。 mRNA是否能够适当地输出到细胞质对于理解Nups的作用是重要的。 在这里，我们描述一种实用的协议，以检测本地烟草的本底细胞中的mRNA的细胞内定位（<本宁顿烟草）。 该方案基于使用与alexa fluor-488缀合的寡聚d（t）探针的poly（a）原位杂交方法。
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