| Assembly of Genetic Circuits with the Mammalian ToolKit
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] The ability to rapidly assemble and prototype cellular circuits is vital for biological research and its applications in biotechnology and medicine. The Mammalian ToolKit (MTK) is a Golden Gate-based cloning toolkit for fast, reproducible and versatile assembly of large DNA vectors and their implementation in mammalian models. The MTK consists of a curated library of characterized, modular parts that can be assembled into transcriptional units and further weaved into complex circuits. These circuits are easily repurposed and introduced in mammalian cells by different methods.
[摘要] [摘要 ] 快速组装和原型细胞电路的能力对于生物学研究及其在生物技术和医学中的应用至关重要。哺乳动物工具箱（MTK）是基于金门大桥的克隆工具箱，用于快速，可复制和通用的大型DNA载体组装及其在哺乳动物模型中的实现。MTK由精选的，模块化的零件组成的精选库组成，这些零件可以组装成转录单位，并进一步编织成复杂的电路。这些电路很容易重新利用，并通过不同的方法引入哺乳动物细胞。
[背景 ] 分子克隆是现代生物技术与重新利用重组DNA导入多种基因电路可以表示目的的频谱的能力的标志。但是，探索遗传电路构建中可能存在的排列的主要局限性在于能否对电路设计进行快速原型设计，测试和实施改进。为了实现这一目标，需要从常规的克隆方法（如Gibson克隆（Akama-Garren 等人，2016）或限制性酶切消化）中加快从设计遗传回路到将其递送至细胞的时间。我们设计了一个框架，在该框架中，传统的基因电路被分解成其组成部分，以便人们可以轻松地交换这些组成部分，以快速组装出巨大的组合，从而评估每次迭代如何影响功能。受早期克隆工具包迭代的启发（Weber 等人，2011 a和2011b ; Duportet 等人，2014; Lee 等人，2015; Martella 等人，2017;Pérez-González 等人，2017; Halleran 等人，2017）等人，2018年; ...
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| Bacterial Microcolonies in Gel Beads for High-throughput Screening
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] High-throughput screening of a DNA library expressed in a bacterial population for identifying potentially rare members displaying a property of interest is a crucial step for success in many experiments such as directed evolution of proteins and synthetic circuits and deep mutational scanning to identify gain- or loss-of-function mutants.
Here, I describe a protocol for high-throughput screening of bacterial (E. coli) microcolonies in gel beads. Single cells are encapsulated into monodisperse water-in-oil emulsion droplets produced with a microfluidic device. The aqueous solution also contains agarose that gelates upon cooling on ice, so that solid gel beads form inside the droplets. During incubation of the emulsion, the cells grow into monoclonal microcolonies ...
[摘要] 在细菌群体中表达的DNA文库的高通量筛选用于鉴定显示感兴趣性质的潜在稀有成员是在许多实验中成功的关键步骤，例如蛋白质和合成回路的定向进化以及用于鉴定增益的深度突变扫描 - 或功能丧失的突变体。
在这里，我描述了一种用于高通量筛选凝胶珠中细菌（大肠杆菌）微菌落的方案。将单细胞包封成用微流体装置产生的单分散油包水乳液液滴。水溶液还含有琼脂糖，其在冰上冷却时凝胶化，从而在液滴内部形成固体凝胶珠。在乳液温育期间，细胞在珠内生长成单克隆微菌落。在从乳液中分离凝胶珠并通过荧光激活细胞分选（FACS）分选后，从凝胶珠中回收细菌，然后准备进行进一步的分选，诱变或分析。为了通过FACS分类，该方案需要荧光读数，例如荧光报告蛋白的表达。测量微小菌落的平均荧光信号降低了高表型细胞间变异性的影响，并且与单细胞分选相比提高了灵敏度。我们应用这种方法在ON和OFF状态下对pBAD启动子文库进行分类（Duarte et al。，2017）。
【背景】荧光激活细胞分选（FACS）具有> 10 7 事件/ h的无与伦比的筛选通量（Davies，2012）。然而，通过FACS根据其荧光分选单个细胞以筛选合成回路的文库（Schaerli和Isalan，2013）经常受到高表型细胞间变异性的阻碍。或者，可以对水凝胶珠中所含的小细胞集落（微集落）进行分类（Weaver ...
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| ARP2/3 Phosphorylation Assay in the Presence of Recombinant Bacterial Effectors
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The Actin-Related Protein 2/3 (ARP2/3) complex is an actin nucleator that generates a branched actin network in mammalian cells. In addition to binding nucleation promoting factors, LeClaire et al. demonstrated that its phosphorylation state is essential key for its activity (LeClaire et al., 2008). In cells, the ARP2/3 complex is phosphorylated on threonine and tyrosine residues of the ARP2, ARP3, and ARPC1 subunits (Vadlamudi et al., 2004; LeClaire et al., 2008; Narayanan et al., 2011; LeClaire et al., 2015). In particular, phosphorylation of threonine 237 and 238 of the ARP2 subunit is necessary to allow a change in the ARP2/3 complex structure to its active conformation (Narayanan et al., 2011; LeClaire et al., ...
[摘要] 肌动蛋白相关蛋白2/3（ARP2 / 3）复合物是在哺乳动物细胞中产生支链肌动蛋白网络的肌动蛋白成核剂。除了结合成核促进因子之外，LeClaire等人。证明其磷酸化状态是其活性的关键（LeClaire等人，2008）。在细胞中，ARP2 / 3复合物在ARP2，ARP3和ARPC1亚基的苏氨酸和酪氨酸残基上磷酸化（Vadlamudi等人，2004; LeClaire等人）。 ，2008; Narayanan等人，2011; LeClaire等人，2015）。特别地，ARP2亚基的苏氨酸237和238的磷酸化对于允许将ARP2 / 3复合物结构改变为其活性构象是必要的（Narayanan等人，2011; LeClaire等人al ，2015）。虽然对于真核细胞中的许多功能很重要，但ARP2 / 3复合物活性也有利于多种细胞病原体（Haglund和Welch，2011; Welch和Way，2013）。最近，我们证明细菌病原体，嗜肺军团菌，使用注射在宿主细胞质细胞中的细菌蛋白激酶来操纵ARP2 / 3复合磷酸化状态（Michard等人，2015） ）。在这里，我们描述如何测试细菌蛋白激酶或另一种蛋白激酶在体外上下文中磷酸化ARP2 / 3复合物的能力。首先，产生和纯化ARP2 / 3复合物和细菌蛋白激酶。然后，将纯化的蛋白质在ATP存在下培养，并通过Western印迹分析ARP2 / ...
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