| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
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| Nuclei Isolation from Nematode Ascaris
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Preparing nuclei is necessary in a variety of experimental paradigms to study nuclear processes. In this protocol, we describe a method for rapid preparation of large number of relatively pure nuclei from Ascaris embryos or tissues that are ready to be used for further experiments such as chromatin isolation and ChIP-seq, nuclear RNA analyses, or preparation of nuclear extracts (Kang et al., 2016; Wang et al., 2016).
[摘要] 在各种实验范例中准备核是必要的，以研究核过程。在本协议中，我们描述了一种从准备用于进一步实验（如染色质分离和ChIP-seq，核RNA）的蛔虫胚胎或组织快速制备大量相对纯的核的方法分析或准备核提取物（Kang等人，2016; Wang等人，2016）。
背景 核分离通常是研究核事件的分子和生物化学方面的第一步。已经开发了几种方法来分离来自不同组织和细胞类型的细胞核。然而，除了C以外的线虫的细胞核分离方案很少。已经描述了线索，（Ooi等人，2010; Zanin等人，2011; Haenni等人，2012， ）。已经使用寄生线虫蛔虫的胚胎来制备用于体外无细胞系统的各种提取物（Cohen等人，2004） ; Lall等人，2004）。然而，这些提取物通常是全细胞提取物。在这里，我们描述了从线虫蛔虫制备细胞核的方法。
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| MHC Class II Tetramer Labeling of Human Primary CD4+ T Cells from HIV Infected Patients
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Major Histocompatibility Complex (MHC) tetramers have been used for two decades to detect, isolate and characterize T cells specific for various pathogens and tumor antigens. In the context of Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection, antigen-specific CD8+ T cells have been extensively studied ex vivo, as they can be readily detected by HIV peptide-loaded MHC class I tetramers. In contrast, the detection of HIV-specific CD4+ T cells has proven more challenging, due to the intrinsically lower clonal expansion rates of CD4+ T cells, and to the preferential depletion of HIV-specific CD4+ T cells in the course of HIV infection.
In the following protocol, we describe a simple method that facilitates the identification of CD4+ ...
[摘要] 主要组织相容性复合物（MHC）四聚体已经使用二十年来检测，分离和表征各种病原体和肿瘤抗原特异性的T细胞。在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的背景下，抗原特异性CD8 +细胞已经在体外广泛研究，因为它们可以容易地被HIV肽 - 加载MHC I类四聚体。相比之下，HIV特异性CD4 + sup + T细胞的检测已被证明更具挑战性，因为CD4 + sup + T细胞的本质上较低的克隆扩增率以及优先艾滋病毒感染过程中艾滋病毒特异性CD4 + T细胞的消耗。＆nbsp;在以下协议中，我们描述了一种简单的方法，该方法有助于使用肽负载的MHC II类四聚体来鉴定HIV-1衣壳表位特异性的CD4 + / T细胞。可以分析四聚体标记的CD4 T细胞的细胞表面表型和/或FACS分选用于进一步的下游应用。成功检测特异性CD4 + / / T细胞离体的关键是选择导致高亲和力T细胞受体（TCR）的肽/ MHC II组合， （Benati等人，2016）。 MHC II四聚体阳性细胞的可靠检测的第二个关键点是系统地使用负载无关肽的对照四聚体，样品和对照管在相同的条件下进行处理。背景 在用抗PE微珠对四聚体-PE标记的细胞进行磁力富集后，在纯化的CD4 + T细胞中检测到罕见的HIV特异性MHC II四聚体阳性细胞（Seth等人， em>。，2005）。我们发现使用经验证的肽/ MHC ...
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