| Purification of FLAG-tagged Secreted Proteins from Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] This protocol describes a method for purifying glycosylated FLAG-tagged secreted proteins with disulfide bonds from mammalian cells. The purified products can be used for various applications, such as ligand binding assays.
[摘要] 该方案描述了一种用于从哺乳动物细胞中用二硫键纯化糖基化的FLAG标记的分泌蛋白的方法。 纯化的产物可用于各种应用，例如配体结合测定。
【背景】电子。大肠杆菌是从原核生物和真核生物生产重组蛋白质的首选生物之一。细菌表达系统的主要优点是生产率高，成本低。然而，成熟蛋白质对于功能分析是必需的（例如，配体结合测定）。大多数分泌的真核蛋白通过共价聚糖键和在内质网中形成二硫键进行翻译后修饰。这些共价修饰对于分泌的成熟蛋白的一般稳定性和折叠是必需的。因此，生产哺乳动物分泌蛋白质的最佳方法是使用哺乳动物宿主来确保经过适当的翻译后修饰的重组蛋白的产生。在以下方案中，我们已经描述了从哺乳动物细胞中纯化分泌蛋白质的详细程序。该方案用于生产标记有FLAG标签的蛋白质，但也适用于其他标记（例如，His标签）蛋白质的蛋白质。
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| Efficient Production of Functional Human NKT Cells from Induced Pluripotent Stem Cells − Reprogramming of Human Vα24+iNKT Cells
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Antigen-specific T cell-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been shown to re-differentiate into functional T cells and thus provide a potential source of T cells that could be useful for cancer immunotherapy. Human Vα24+ invariant natural killer T (Vα24+iNKT) cells are subset of T cells that are characterized by the expression of an invariant Vα24-Jα18 paired with Vβ11, that recognize glycolipids, such as α-galactosylceramide (α-GalCer), presented by the MHC class I-like molecule CD1d. Vα24+iNKT cells capable of producing IFN-γ are reported to augment anti-tumor responses, which affects both NK cells and CD8+ cytotoxic T lymphocytes to eliminate MHC- and MHC+ tumor cells, respectively. Here we describe a ...
[摘要] 抗原特异性T细胞来源的诱导多能干细胞（iPSCs）已显示重新分化为功能性T细胞，从而提供可用于癌症免疫治疗的T细胞的潜在来源。不变性自然杀伤T（Vα24 + iNKT）细胞的人Vα24 + 细胞是T细胞的子集，其特征在于与Vβ11配对的不变Vα24-Jα18的表达，其识别糖脂，如α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer），由MHC I类分子CD1d呈递。据报道能够产生IFN-γ的Vα24 + i / KT细胞增加抗肿瘤反应，其影响NK细胞和CD8 +细胞毒性T淋巴细胞以消除MHC - 和MHC + 肿瘤细胞。在这里，我们描述了将人Vα24 + iNKT细胞重编程到iPSC中的鲁棒方案，然后将其重新分化为Vα24 + iNKT细胞（iPS-Vα24功能的iNKT）。我们进一步提供了测定iPS-Vα24 + iNKT细胞活性的方案。背景 以前有报道说，针对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）和头颈部癌症的Vα24 + iNKT细胞癌免疫治疗的临床试验显示疗效，耐受性良好（Motohashi et al。等人，2009; Yamasaki等人，2011）。然而，已知来自外周血单核细胞（PBMC）的Vα24 ...
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| In silico Analysis and Site-directed Mutagenesis of Promoters
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] In normal as in cancerous cells, gene expression is tightly regulated by transcription factors, which are responsible for up- or down-regulation of thousands of targets involved in different cell processes. Transcription factors can directly regulate the expression of genes by binding to specific DNA sequences known as response elements. Identification of these response elements is important to characterize targets of transcription factors in order to understand their contribution to gene regulation. Here, we describe In silico analysis coupled to selected mutagenesis and promoter gene reporter assay procedures to identify and analyze response elements in the proximal promoter sequence of genes.
[摘要] 正常情况下，在癌细胞中，基因表达受转录因子的严格调节，转录因子负责上调或下调参与不同细胞过程的成千上万个靶标。转录因子可以通过结合被称为反应元件的特定DNA序列直接调节基因的表达。识别这些响应元件对于表征转录因子的目标是重要的，以便了解它们对基因调控的作用。在这里，我们描述了与选定的诱变和启动子基因报告物测定程序相结合的电子分析，以鉴定和分析基因的近端启动子序列中的应答元件。
背景 转录因子对全球基因表达的影响可以通过其使用shRNA或CRISPR-Cas9方法的敲低来进行研究，然后进行微阵列分析，可以提供数百个失调基因的重要数据。这种分析虽然非常有用，但缺乏关于失调基因直接控制的信息。为了进一步研究这些基因，使用生物信息学的电子分析分析提供了额外的信息来鉴定研究的转录因子的直接靶标。另外，可以使用定点突变和启动子 - 基因 - 报道分析来分析这些响应元件的功能。我们最近已经表明，致癌转录因子MYC（细胞性骨髓细胞瘤癌基因）控制结肠直肠癌中ITGA1（整联蛋白α1亚基）基因的表达，并且它们的表达在72％的结肠直肠肿瘤中相关。该协议描述了用于分析ITGA1启动子的程序和用于MYC致癌基因的响应元件的鉴定。后者已知是MYC / MAX / MAD网络的成员。这些因素之间的相互作用导致基因激活或抑制，这取决于上游信号和细胞条件。
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