| A Quick and Easy Method for Making Competent Escherichia coli Cells for Transformation Using Rubidium Chloride
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] This protocol describes a quick and efficient method to make competent E. coli cells for transformation using rubidium chloride. Commercial competent cells are expensive and this protocol provides a cheaper alternative to them.
[摘要] 这个协议描述了一个快速有效的方法来做出胜任的E。 使用氯化铷转化大肠杆菌细胞。 商业感受态细胞是昂贵的，这个协议提供了一个更便宜的选择。
【背景】基因克隆的成功高度依赖于细菌细胞的转化效率。 通过用化学物质或电脉冲处理细胞可以人为地提高效率。 有几个协议可用于准备主管的E。 然而，它们通常是长期的，费力的，并且在能力上表现出不一致。 Green和Rogers（2013）的方案克服了这些缺点，并允许制备高感受态细胞（〜10 6 -10 8 CFU /μgDNA）。 虽然其他协议要求细胞在低温（19-22°C）下生长，但该协议涉及在37°C下生长细胞。 因此，与18-24小时相比，细胞生长更快并且在4小时内达到对数期。 该协议是高度可重复的。
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| Assay to Access Anthelmintic Activity of Small Molecule Drugs Using Caenohabidtis elegans as a Model
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] This protocol proposes to use the nematode Caenorhabditis elegans as a model to screen and study the anthelmintic activity of natural and synthetic compounds and to observe their effects on the morphology and the ultrastructure of the helminths. Furthermore, C. elegans can be used to investigate the anthelmintic activity in embryonated eggs, larval stages and in the adults’ survival. As most current anthelmintics are not effective against all nematode life stages, this protocol can contribute to the identification of new alternatives to helminthic infections (Sant’Anna et al., 2016).
[摘要] 该方案建议使用线虫秀丽隐杆线虫作为模型来筛选和研究天然和合成化合物的驱虫活性，并观察其对趾甲的形态和超微结构的影响。此外，C。线虫可用于研究胚胎卵，幼虫期和成年人生存期的驱虫活性。由于目前的大多数驱虫药对所有的线虫生命阶段均无效，因此该方案可有助于确定蠕虫感染的新替代品（2016年Sant'Anna等人）。
背景 秀丽隐杆线虫是寄生线虫研究的典型生物，是具有潜在驱虫活性的化合物筛选的优良系统，因为它便宜，易于获得并且易于使用。另外，使用 C。线虫在调查线虫行为，运动，繁殖和死亡的测定中是不复杂和可靠的（Simpkin和Coles，1981）。用于筛选新化合物的方案。首先在深孔显微镜载玻片（Tomlinson等人，1985）中的无菌液体培养基中进行线虫，或使用加入熔融修饰的NGM琼脂中的药物（Driscoll等人，1989）。这些方法在药物筛选中无效，因为含有低食物供应的无菌培养物，引发子宫内出生导致产妇死亡（“内毒素”）（Lenaerts等人） 2008），添加到熔化琼脂中的药物可以改善由于高温导致的药物稳定性。在该方案中，我们使用96孔平板与大肠杆菌供应的液体培养基独立地评估每个阶段（卵，L1-L2幼虫，L3-L4幼虫和成年人）。
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| Determination of Pseudokinase-ligand Interaction by a Fluorescence-based Thermal Shift Assay
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Author:
Date:
2014-06-05
[Abstract] This protocol describes a robust technique for the measurement of pseudokinase-ligand interaction by a fluorescence-based Thermal Shift Assay (TSA). Pseudokinases are kinase-like proteins that have recently emerged as crucial regulators of signal transduction and may therefore represent a novel class of drug targets. Unlike kinases, the catalytic efficiency of pseudokinases is rather poor or non existent, making it difficult to dissect the function of their nucleotide binding sites. Thermal denaturation-based methods have proven to be a powerful method for determining ligand binding capacity to purified pseudokinases and can inform on the potential drugability of the nucleotide binding site. This assay takes advantage of a change in flurorescence arising when a flurorescence dye, in ...
[摘要] 该协议描述了通过基于荧光的热漂移测定（TSA）测量假激酶 - 配体相互作用的鲁棒技术。假激酶是激酶样蛋白，其最近作为信号转导的关键调节剂出现，因此可以代表一类新型的药物靶标。与激酶不同，假激酶的催化效率相当差或不存在，使得难以解析其核苷酸结合位点的功能。已证明基于热变性的方法是确定与纯化的假激酶的配体结合能力的有力方法，并且可以告知核苷酸结合位点的潜在可药物性。该测定利用了当荧光染料（在这种情况下为SYPROOrange）与当蛋白质经历热变性时暴露的疏水性贴片结合时产生的荧光变化。已知配体结合蛋白质增加其热稳定性，其通过在未配对蛋白质和配体蛋白质之间的热变性曲线中观察到的移动来反映。这一广义协议也可以适合于其他蛋白家族。此外，基于热变性的方法可用于鉴定可提高蛋白质稳定性的最佳缓冲液条件
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