| Biochemical Assays for MTase Activity
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Author:
Date:
2014-01-20
[Abstract] Methyltransferase (MTase) transfers a methyl group (-CH3) from the donor S-adenosyl-L-methionine (AdoMet or SAM) to biologically active molecules such as hormones, neurotransmitters, lipids, proteins and nucleic acids. The addition of a methyl group causes a change in the physicochemical properties of the molecules. The mRNA cap structure is essential for cell and virus. Guanine-N7-methyltransferase (N7-MTase) methylates the GpppN cap at the N7 position of guanine, resulting in cap-0 structure (m7GpppN), and Ribose 2'-O-MTase further methylates the first nucleotide of higher eukaryotic cellular and viral mRNAs at the ribose 2'-OH position to form cap-1 (m7GpppNm) structures. Here, we describe a biochemical assay to detect the activities of mRNA capping MTases.
[摘要] 甲基转移酶（MTase）将甲基（-CH 3）从供体S-腺苷-L-甲硫氨酸（AdoMet或SAM）转移到生物活性分子例如激素，神经递质，脂质，蛋白质和核酸。 加入甲基引起分子的物理化学性质的改变。 mRNA帽结构对于细胞和病毒是必需的。 鸟嘌呤-N7-甲基转移酶（N7-MTase）甲基化在鸟嘌呤的N7位置的GpppN帽，导致cap-0结构（m7GpppN），核糖2'-O-MTase进一步甲基化高等真核细胞和病毒的第一个核苷酸 mRNA在核糖2'-OH位置形成cap-1（m7GpppNm）结构。 在这里，我们描述一种生物化学测定检测mRNA上限MTases的活动。
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| Analysis of RNA-protein Interactions Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (Gel Shift Assay)
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Author:
Date:
2013-11-20
[Abstract] RNA binding proteins (RBPs) play a crucial role in regulating gene expression at the post-transcriptional level at multiple steps including pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA stability, mRNA localization and translation. RBPs regulate these processes primarily by binding to specific sequence elements in nascent or mature transcripts. There are several hundreds of RBPs in plants, but the targets of most of them are unknown. A variety of experimental methods have been developed to identify targets of an RBP. These include RNA immunoprecipitation (RIP), UV cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) and many variations of CLIP (e.g. PAR-CLIP, iCLIP). These approaches depend on immunoprecipitation of RNAs bound to a specific RBP using an antibody to that RBP. Electrophoretic ...
[摘要] RNA结合蛋白（RBP）在包括前mRNA剪接，多聚腺苷酸化，mRNA稳定性，mRNA定位和翻译的多个步骤在调节转录后水平的基因表达中起关键作用。 RBP主要通过结合新生或成熟转录物中的特定序列元件来调节这些过程。植物中有几百个RBP，但其中大多数的目标是未知的。已经开发了各种实验方法来鉴定RBP的目标。这些包括RNA免疫沉淀（RIP），UV交联和免疫沉淀（CLIP）和CLIP的许多变体（例如PAR-CLIP，iCLIP）。这些方法取决于使用针对该RBP的抗体与特异性RBP结合的RNA的免疫沉淀。电泳迁移率变动分析（EMSA），也称为凝胶移位分析，已被用于分析蛋白质 - 核酸相互作用。它是一种简单而强大的方法来分析蛋白质-RNA/DNA相互作用。在RNA EMSA中，通过在蛋白质存在下比较RNA的迁移来可视化RNA-蛋白质复合物。通常，在RNA EMSA中，使用特异性RNA序列来分析其与蛋白质的相互作用。将具有荧光标记的体外转录的32 P标记的或化学合成的RNA与或不与目标蛋白一起温育，然后将反应混合物在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行。 RNA-蛋白复合物与游离RNA相比缓慢迁移，其可以使用成像系统可视化。除了测试RBP与RNA的结合之外，EMSA还用于绘制参与相互作用的RNA和/或蛋白质中的区域。此外，还可以使用EMSA定量结合亲和力。
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