| FRET-based Stoichiometry Measurements of Protein Complexes in vitro
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] For a complete understanding of biochemical reactions, information on complex stoichiometry is essential. However, measuring stoichiometry is experimentally challenging. Our lab has developed a FRET-based assay to study protein complex stoichiometry in vitro. This assay, also known as Job plot, is set up as a continuous variation of the molar ratio between the two species, kept at constant total concentration. The FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) between the two fluorescently-labeled proteins is measured and the stoichiometry is inferred from the sample with highest FRET signal. This approach allows us to assess complex stoichiometry in solution.
[摘要] 为了全面了解生化反应，复杂的化学计量学信息是必不可少的。 然而，测量化学计量学在实验上是具有挑战性的。 我们的实验室已经开发了基于FRET的测定法来研究蛋白质复合体化学计量体外。 该测定法也被称为作业区，其被设定为两种物质之间的摩尔比的连续变化，保持恒定的总浓度。 测量两种荧光标记蛋白之间的FRET（荧光共振能量转移），并从具有最高FRET信号的样品中推断化学计量。 这种方法使我们能够评估溶液中复杂的化学计量。
【背景】每个生物化学反应需要两种或更多种细胞组分之间的相互作用。这些相互作用的化学计量是调节细胞生物化学反应的重要因素。因此，复杂化学计量的实验确定对于充分了解细胞内工作的生物化学和生物物理学过程至关重要。
测量化学计量具有实验上的挑战性。化学计量可以通过低分辨率结构分析来推断。这些方法包括尺寸排阻色谱法，多角度光散射，分析超速离心，其能够提供粒子的精确分子量。但是，这些方法被认为是次要的。
基于FRET（荧光共振能量转移）的溶液中的化学计量。这种测定方法称为工作区（Huang，1982），可以用较少的材料进行，更适合研究任何复杂的地层，与两种成分的大小无关。在该测定中，样品保持恒定的总蛋白质浓度，但两种组分之间的摩尔比连续变化（图1）。具有复合物功能化学计量的样品希望显示最高的FRET信号。
这是获得溶液中复杂化学计量和任何大小组分之间测量的有力方法。因为FRET测量需要复合物的两个组分都被荧光标记，所以需要各种对照来排除标记过程的潜在伪影。理想的情况是单个位点的标记在该测定中是可取的（D'Arcy等人，2013; ...
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| Mouse Satellite Cell Isolation and Transplantation
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Satellite cell (SC) transplantation represents a powerful strategy to investigate SC biology during muscle regeneration. We described here a protocol for SC isolation from green fluorescent protein (GFP)-expressing mice and their transplantation into murine muscles. This procedure was originally used to assess the effects of the hormone unacylated ghrelin on muscle regeneration, in particular evaluating how the increase of unacylated ghrelin in the recipient muscle affected the engraftment of donor SCs (Reano et al., 2017).
[摘要] 卫星细胞（SC）移植代表了肌肉再生期间SC生物学研究的强大策略。 我们在这里描述了从绿色荧光蛋白（GFP）表达的小鼠和他们的小鼠肌肉移植SC分离的协议。 该程序最初用于评估激素非酰化生长素释放肽对肌肉再生的影响，特别是评估受体肌肉中未酰化的生长素释放肽的增加如何影响供体SC的植入（Reano等人，2017年）。
【背景】由分化的肌纤维组成的骨骼肌可以在受伤时再生。肌肉再生依赖于居住在肌肉纤维基底层之下的称为卫星细胞（SC）的静止驻留干细胞群（Mauro，1961）。受伤后，SC经历激活，广泛的增殖，分化和融合，最终修复或替换受损的肌纤维（Collins等人，2005）。
由于移植的成肌细胞可以与宿主成肌细胞融合，因此SC的移植被认为是杜氏肌营养不良症（DMD）的潜在疗法多年的时间，这提示了在缺陷纤维中功能性修复的可能性（Partridge ...
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| Porous Scaffold Seeding and Chondrogenic Differentiation of BMSC-seeded Scaffolds
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2015-12-20
[Abstract] Bone marrow-derived mesenchymal stromal stem cells (BMSCs) are a promising cell source for treating articular cartilage defects (Bornes et al., 2014). BMSCs can be seeded within porous biomaterial scaffolds that support three-dimensional cell organization, chondrogenic differentiation and extracellular matrix deposition for the creation of engineered cartilage. This protocol describes our defined methods for isolation and expansion of human and ovine BMSCs, seeding of BMSCs within porous scaffolds and in vitro chondrogenic differentiation (Adesida et al., 2012; Bornes et al., 2015).
[摘要] 骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）是治疗关节软骨缺陷的有希望的细胞来源（Bornes等人，2014）。 BMSCs可以种植在支持三维细胞组织，软骨形成分化和细胞外基质沉积的多孔生物材料支架中，用于创建工程化软骨。 该方案描述了我们定义的用于分离和扩增人和绵羊BMSCs，在多孔支架内接种BMSCs和在体外软骨形成分化的方法（Adesida等人，2012; Bornes et al。，2015）。
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