| A Quantitative Heterokaryon Assay to Measure the Nucleocytoplasmic Shuttling of Proteins
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Many proteins appear exclusively nuclear at steady-state but in fact shuttle continuously back and forth between the nucleus and the cytoplasm. For example, nuclear RNA-binding proteins (RBPs) often accompany mRNAs to the cytoplasm, where they can regulate subcellular localization, translation and/or decay of their cargos before shuttling back to the nucleus. Nucleocytoplasmic shuttling must be tightly regulated, as mislocalization of several RBPs with prion-like domains such as FUS and TDP-43 causes the cytoplasmic accumulation of solid pathological aggregates that have been implicated in neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). Traditionally, interspecies heterokaryon assays have been used to determine whether a nuclear ...
[摘要] 许多蛋白质在稳态下仅出现核，但事实上在细胞核和细胞质之间连续地来回穿梭。例如，核RNA结合蛋白（RBP）通常伴随mRNA到达细胞质，在那里它们可以在穿梭回到细胞核之前调节其货物的亚细胞定位，翻译和/或腐烂。必须严格调节核质穿梭，因为几种RBP与朊病毒样结构域如FUS和TDP-43的错误定位导致固体病理性聚集体的细胞质积累，这些聚集体与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆等神经退行性疾病有关。 （FTD）。传统上，种间异核体分析已被用于确定感兴趣的核蛋白是否穿梭;这些分析是基于来自两个不同物种（例如，小鼠和人类）的供体和受体细胞之间的融合，可以根据不同的染色质染色模式区分，并检测蛋白质的外观。受体核。然而，异核体的鉴定需要经验并且容易出错，这使得难以获得用于定量研究的高质量数据。此外，荧光标记的RBP在供体细胞中的瞬时过表达通常导致其异常的亚细胞定位。在这里，我们提出定量测定，其中表达接近生理水平的eGFP标记的RBP的稳定供体细胞系与表达膜标记物CAAX-mCherry的受体细胞融合，允许容易地鉴定和成像大量高可信度异核体。我们的测定法可用于测量任何感兴趣的核蛋白在不同细胞类型，不同细胞条件下或突变蛋白之间的穿梭活性。
【背景】要了解蛋白质的各种功能，重要的是找出它在细胞内定位的位置。标准的微观和生物化学方法仅在其稳态浓度高于检测阈值时才揭示蛋白质的存在。他们不排除它在短暂地定位的情况下扮演其他重要角色的可能性（Gama-Carvalho和Carmo-Fonseca，2001）。例如，许多RBP在不同的细胞区室中发挥作用，它们伴随着它们的结合mRNA（通常未检测到）并连接真核基因表达的多个步骤（Müller-McNicoll和Neugebauer，2013）。 ...
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| Laminarin Quantification in Microalgae with Enzymes from Marine Microbes
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] The marine beta-glucan laminarin is an abundant storage polysaccharide in microalgae. High production rates and rapid digestion by heterotrophic bacteria turn laminarin into an ideal carbon and energy source, and it is therefore a key player in the marine carbon cycle. As a main storage glucan laminarin also plays a central role in the energy metabolism of the microalgae (Percival and Ross, 1951; Myklestad, 1974; Painter, 1983). We take advantage of enzymes that digest laminarin selectively and can thereby quantify only this polysaccharide in environmental samples. These enzymes hydrolyze laminarin into glucose and oligosaccharides, which are measured with a standard reducing sugar assay to obtain the laminarin concentration. Prior to this assay, the three enzymes need to be produced via ...
[摘要] 海洋β-葡聚糖昆布多糖是微藻中丰富的储存多糖。高生产率和异养细菌的快速消化将昆布多糖转化为理想的碳源和能源，因此它是海洋碳循环的关键参与者。作为主要的储存葡聚糖昆布多糖也在微藻的能量代谢中发挥核心作用（Percival and Ross，1951; Myklestad，1974; Painter，1983）。我们利用可以选择性消化昆布多糖的酶，从而可以对环境样品中的这种多糖进行定量。这些酶将昆布多糖水解成葡萄糖和寡糖，用标准的还原糖测定法测定得到昆布多糖浓度。在此测定之前，需要通过异源表达和纯化产生三种酶。该测定可用于监测环境微藻中的昆布多糖浓度，其通过过滤从海水中浓缩，或用来自藻类实验室培养物的样品中浓缩。
【背景】海洋多糖在海洋碳循环中起着重要作用，是浮游植物生理学的重要组成部分，但受到严重影响。几十年来，农业食品工业一直使用基于酶分析的即用试剂盒来分析各种不同的多糖（Whitaker，1974）。这些快速，稳健和特异性的基于酶的方法评估源自陆地植物即淀粉的多糖，因为它们广泛用于食品，饲料和其他工业应用中（Brunt等人， ，1998）。然而，海洋多糖的类似测定仍然缺乏。受到使用酶在藻类中进行多糖定量的想法的启发，我们开发了一种基于酶的方法来量化在硅藻和其他微藻中生态相关的β-葡聚糖昆布氨酸，也称为菊科金刚烷。
这种应用的三种糖苷水解酶（GH）来自福尔摩沙（Formosa）。并且它们的特征如下：FbGH30是GH30家族的外切型β-1,6-葡聚糖酶，特别是水解与昆布多糖骨架连接的β-1,6-连接的葡萄糖单体分支;并且FaGH17A和FbGH17A是GH家族17的两种内作用β-1,3-葡聚糖酶，其特异性地作用于β-1,3-连接的昆布多糖主链上（Becker等人，2017年， ...
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| Analysis of N-acetylmuramic acid-6-phosphate (MurNAc-6P) Accumulation by HPLC-MS
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] We describe here in detail a high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)-based method to determine N-acetylmuramic acid-6-phosphate (MurNAc-6P) in bacterial cell extracts. The method can be applied to both Gram-negative and Gram-positive bacteria, and as an example we use Escherichia coli cells in this study. Wild type and mutant cells are grown for a defined time in a medium of choice and harvested by centrifugation. Then the cells are disintegrated and soluble cell extracts are generated. After removal of proteins by precipitation with acetone, the extracts are analyzed by HPLC-MS. Base peak chromatograms of wild type and mutant cell extracts are used to determine a differential ion spectrum that reveals differences in the MurNAc-6P content of ...
[摘要] 我们在这里详细描述了一种基于高效液相色谱 - 质谱（HPLC-MS）的方法，以确定细菌细胞提取物中的N-乙酰谷氨酸-6-磷酸（MurNAc-6P）。该方法可以应用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，作为一个例子，我们在本研究中使用大肠杆菌细胞。野生型和突变型细胞在选择的培养基中生长一定时间并通过离心收获。然后细胞分解并产生可溶性细胞提取物。通过用丙酮沉淀除去蛋白质后，通过HPLC-MS分析提取物。野生型和突变型细胞提取物的基本峰图谱用于测定显示两种样品中MurNAc-6P含量差异的差异离子谱。确定阴离子模式下MurNAc-6P（（MH）= 372.070m/z的提取色谱图的峰面积允许定量使用的MurNAc-6P水平计算消泡聚糖的MurNAc含量的回收率。
【背景】在细菌生长期间，大部分细菌的肽聚糖细胞壁稳定地翻转并可能回收（再循环）。 肽聚糖回收代谢的关键化合物是积聚在大肠杆菌的MurNAc-6P醚酶（MurQ）突变体中的N-乙酰谷氨酸-6-磷酸（MurNAc-6P） （Jaeger等人，2005; Uehara等人，2006）。 MurQ直向同源物被发现在许多细菌中，包括革兰氏阳性菌（Litzinger等人，2010; Reith和Mayer，2011）。 ...
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