| Functional Evaluation of the Signal Peptides of Secreted Proteins
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Here, we describe a method that can be used to evaluate the function of predicted signal peptides. This method utilizes the yeast Saccharomyces cerevisiae YTK12 strain and pSUC2 vector in which the pSUC2 vector with fused predicted signal peptide is transformed into yeast. The function of the signal peptides can be evaluated by using different selective media and color reaction. In this protocol, we provide the detailed description of manipulation in order to implement easily.
[摘要] 在这里，我们描述了一种可用于评估预测信号肽功能的方法。 该方法利用酵母酿酒酵母YTK12菌株和pSUC2载体，其中将具有融合的预测信号肽的pSUC2载体转化到酵母中。 信号肽的功能可以通过使用不同的选择性培养基和显色反应来评估。 在这个协议中，我们提供了操作的详细描述以便轻松实现。
【背景】微生物真核生物，如真菌和卵菌，可以分泌丰富的蛋白质来发挥各种功能。目前，从氨基酸序列预测信号肽的最广泛使用的方法是使用软件SignalP（Petersen等人，2011）。酵母YTK12菌株为转化酶阴性，pSUC2载体含有转化酶基因但缺少甲硫氨酸（Met）和信号肽序列，因此YTK12菌株和pSUC2载体广泛用于肽分泌的生物学评价（Jacobs等人 >，1997; Oh等人，2009）。此外，颜色反应可用于验证结果，因为转化酶的酶活性可以通过将2,3,5-三苯基氯化四唑（TTC）还原成不溶性红色1,3,5-三苯甲forma胺（TPF ）。尽管该方法一般用于评估信号肽的功能，但没有关于该方法的具体和详细的信息（Oh等人，2009; Song等人 >，2015）。在这里，我们描述了一种改进的高效酵母转化方法（Gietz和Schiestl，2007）和详细的方案来评估信号肽的功能，这将是分泌蛋白质研究的主要部分。
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| Using CRISPR/Cas9 for Large Fragment Deletions in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) systems have emerged as a powerful tool for genome editing in many organisms. The wide use of CRISPR/Cas9 systems may be due to the fact that these systems contain a simple guide RNA (sgRNA) that is relatively easy to design and they are very versatile with the ability to simultaneously target multiple genes within a cell (Varshney et al., 2015). We have developed a CRISPR/Cas9 system to delete large genomic fragments (exceeding 30 kb) in Saccharomyces cerevisiae. One application of this technology is to study the effects of large-scale deletions of non-essential genes which may give insight into the function of gene clusters within chromosomes at the molecular level. In ...
[摘要] CRISPR / Cas9（集群定期间隔的短回文重复/ CRISPR相关蛋白9）系统已经成为许多生物体中基因组编辑的有力工具。 CRISPR / Cas9系统的广泛使用可能是由于这些系统包含相对容易设计的简单导向RNA（sgRNA），并且它们具有同时靶向细胞内多个基因的能力非常通用的事实（Varshney 等，，2015）。我们开发了一种CRISPR / Cas9系统来删除酿酒酵母中的大型基因组片段（超过30 kb）。该技术的一个应用是研究非必需基因的大规模缺失的影响，这可以了解染色体内基因簇在分子水平上的功能。在这个协议中，我们描述了在 S中大片段删除的一般程序。包括：如何设计CRISPR数组，以及如何构建Cas9-crRNA表达质粒，以及如何检测系统内引入的突变。细胞。
【背景】CRISPR / Cas9系统是一种快速，高效，低成本，多用途的基因组编辑方法，可应用于生物学，农业学和医学领域。迄今为止，已经有几个方案报告了如何在基因组内进行大规模的缺失。这些方法中的每一种都包含其独特的特征和优点。最近开发的用于切除大片染色体的CRISPR / Cas9系统具有优于其他方法（例如Latour系统）（Hirashima等人，2006）的优势。 CRISPR / ...
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| Expression, Purification and Crystallization of the Herpesvirus Nuclear Egress Complex (NEC)
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Author:
Date:
2016-07-20
[Abstract] The protocol describes the production and crystallization of the soluble form of the nuclear egress complex (NEC) from Herpes simplex virus 1 and Pseudorabies virus. The NEC is a heterodimer that consists of conserved proteins UL31 and UL34. NEC oligomerization deforms the inner nuclear membrane around the capsid in infected cells, thereby mediating capsid budding into the perinuclear space during nuclear egress. We have successfully developed a protocol for large-scale preparation of highly pure NEC from two different viruses in a prokaryotic expression system, which enabled us to crystallize these viral protein complexes and determine their structures. This procedure may be adapted to purify and crystallize other soluble protein complexes.
[摘要] 该协议描述了来自单纯疱疹病毒1和伪狂犬病病毒的核出口复合物（NEC）的可溶形式的产生和结晶。 NEC是由保守蛋白UL31和UL34组成的异源二聚体。 NEC低聚使受感染细胞中的衣壳周围的内核膜变形，从而在核出口期间介导衣壳发芽进入核周空间。 我们已经成功地开发了一个协议，从大规模制备高纯度NEC从两种不同的病毒在原核表达系统，这使我们能够结晶这些病毒蛋白复合物和确定其结构。 该程序可适于纯化和结晶其它可溶性蛋白质复合物。
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