| Purifying Properly Folded Cysteine-rich, Zinc Finger Containing Recombinant Proteins for Structural Drug Targeting Studies: the CH1 Domain of p300 as a Case Example
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The transcription factor Hypoxia-Inducible Factor (HIF) complexes with the coactivator p300, activating the hypoxia response pathway and allowing tumors to grow. The CH1 and CAD domains of each respective protein form the interface between p300 and HIF. Small molecule compounds are in development that target and inhibit HIF/p300 complex formation, with the goal of reducing tumor growth. High resolution NMR spectroscopy is necessary to study ligand interaction with p300-CH1, and purifying high quantities of properly folded p300-CH1 is needed for pursuing structural and biophysical studies. p300-CH1 has 3 zinc fingers and 9 cysteine residues, posing challenges associated with reagent compatibility and protein oxidation. A protocol has been developed to overcome such issues by incorporating ...
[摘要] 与共激活因子p300的转录因子缺氧诱导因子（HIF）复合物，激活缺氧反应途径并允许肿瘤生长。每个相应蛋白质的CH1和CAD结构域形成p300和HIF之间的界面。正在开发靶向和抑制HIF / p300复合物形成的小分子化合物，目的是减少肿瘤生长。研究配体与p300-CH1相互作用的高分辨NMR光谱是必要的，为了进行结构和生物物理学研究，需要净化大量正确折叠的p300-CH1。 p300-CH1具有3个锌指和9个半胱氨酸残基，构成与试剂相容性和蛋白氧化相关的挑战。已经开发了一种通过在表达过程中并入锌并简化纯化时间来克服这些问题的方案，导致适合于结构NMR研究的最佳折叠蛋白质（120mg / 4L表达介质）的高产率。已证实最终重组p300-CH1的结构完整性是使用一维1 H NMR光谱和圆二色性最优的。该方案适用于纯化其他含锌指蛋白质。
【背景】由于不适当的血管灌注，实体瘤的发展与缺氧区的发展有关。对于缺氧微环境，肿瘤细胞过表达低氧诱导因子（HIF），一种异二聚体转录因子家族（Semenza，2002; Brat和Van Meir，2004; Kaur等，2005）。 HIFs结合p300（一种转录共激活因子），形成诱导HIF靶基因的复合物，从而激活缺氧反应途径并促进肿瘤生长（Kasper and Brindle，2006; Liu，2008）。涉及HIF / p300蛋白 ...
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| Single Genome Sequencing of Expressed and Proviral HIV-1 Envelope Glycoprotein 120 (gp120) and nef Genes
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] The current study provides detailed protocols utilized to amplify the complete HIV-1 gp120 and nef genes from single copies of expressed or integrated HIV present in fresh-frozen autopsy tissues of patients who died while on combined antiretroviral therapy (cART) with no detectable plasma viral load (pVL) at death (Lamers et al., 2016a and 2016b; Rose et al., 2016). This method optimizes protocols from previous publications (Palmer et al., 2005; Norström et al., 2012; Lamers et al., 2015; 2016a and 2016b; Rife et al., 2016) to produce single distinct PCR products that can be directly sequenced and includes several cost-saving and time-efficient modifications.
[摘要] 目前的研究提供了详细的方案，用于扩增完整的HIV-1 gp120和nef基因，从单个拷贝的表达或综合的HIV存在于新鲜冷冻尸检组织中，在联合抗逆转录病毒治疗（cART）而死亡的患者中，没有可检测的血浆病毒 死亡时负荷（pVL）（Lamers等，2016a和2016b; Rose等，2016）。 该方法优化了以前的出版物（Palmer等，2005;Norström等，2012; Lamers等，2015; 2016a和2016b; Rife等，2016）的方案，以产生可以直接的单独不同的PCR产物 测序并包括若干成本节约和时间有效的修改。
【背景】三十多年前，艾滋病毒感染及其临床表现，即获得性免疫缺陷综合征（AIDS），已成为全球流行病。此后，对艾滋病病毒发病机制的认识已经出现，药物治疗的发展显着延长了患者的生命。目前的cART方案包括以几种方式抑制病毒复制的各种药物，其允许几乎完全抑制血液中发现的病毒颗粒和恢复健康的CD4 + T细胞群体（CD4 +）（Autran等人，1997 ）。然而，cART治疗患者血浆中持续存在非常低水平的艾滋病毒，即使是经过数十年治疗的患者，也表明存在一种以病毒为基础的细胞库。病毒储库包含不释放感染性病毒（即被潜在感染）的感染细胞，但可以在活化后进行，这可能在各种条件下发生（Chun等，1995和1997）。 ...
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| Dense sgRNA Library Construction Using a Molecular Chipper Approach
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Genetic screens using single-guide-RNA (sgRNA) libraries and CRISPR technology have been powerful to identify genetic regulators for both coding and noncoding regions of the genome. Interrogating functional elements in noncoding regions requires sgRNA libraries that are densely covering, and ideally inexpensive, easy to implement and flexible for customization. We present a Molecular Chipper protocol for generating dense sgRNA libraries from genomic regions of interest. This approach utilizes a combination of random fragmentation and a Type III restriction enzyme to derive a dense coverage of sgRNA library from input DNA.
[摘要] 使用单导向RNA（sgRNA）文库和CRISPR技术的遗传筛选功能强大可以识别基因组编码区和非编码区的遗传调控因子。 在非编码区域中询问功能元件需要密集覆盖的sgRNA文库，理想的便宜，易于实现和灵活定制。 我们提出了一个分子切片方案从感兴趣的基因组区域产生密集的sgRNA文库。 该方法利用随机断裂和III型限制酶的组合从输入DNA导出sgRNA文库的致密覆盖。
【背景】使用化脓性链球菌（sp）的基因组编辑Cas9和sgRNA文库是通过产生双重缺失功能序列改变来筛选哺乳动物细胞功能性遗传调节因子的有力工具（Wiedenheft et al。，2012; Mali et al。，2013; Koike-Yusa等，2014; Shalem等，2014; Wang等，2014; Zhou等，2014）。 Cas9结合sgRNA，其可被设计为将Cas9靶向基因组中定义的基因座。 Cas9的核酸酶活性切割靶DNA位点，导致双链DNA断裂，在通过非同源末端连接途径进行DNA修复时，经常导致感兴趣的基因座短缺失。
CRISPR-Cas9系统强大的基因组编辑能力导致使用sgRNA文库来询问蛋白质编码基因以及非编码区域。通过sgRNA富集功能筛选，报告了几种用于蛋白质编码基因和/或有限数量的非编码基因的sgRNA文库，以鉴定调控特定细胞功能的基因和网络（Koike-Yusa等，2014; ...
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