| Quantitative Live-cell Reporter Assay for Noncanonical Wnt Activity
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Noncanonical Wnt signaling functions independently of the β-catenin pathway to control diverse developmental processes, and dysfunction of the pathway contributes to a number of human pathological conditions, including birth defects and metastatic cancer. Progress in the field, however, has been hampered by the scarcity of functional assays for measuring noncanonical Wnt signaling activity. We recently described the Wnt5a-Ror-Kif26b (WRK) reporter assay, which directly monitors a post-transcriptional regulatory event in noncanonical Wnt signaling. In this protocol, we describe the generation of the stable GFP-Kif26b reporter cell line and a quantitative reporter assay for detecting and measuring Wnt5a signaling activities in live cells via flow cytometry.
[摘要] 非经典Wnt信号独立于β-catenin途径发挥功能来控制不同的发育过程，并且该途径的功能障碍导致许多人类病理状况，包括出生缺陷和转移性癌症。 然而，该领域的进展一直受到用于测量非典型Wnt信号活性的功能测定的稀缺性的阻碍。 我们最近描述了Wnt5a-Ror-Kif26b（WRK）记者测定法，其直接监测非典型Wnt信号传导中的转录后调节事件。 在该协议中，我们描述了通过流式细胞术检测和测量活细胞中Wnt5a信号传导活性的稳定GFP-Kif26b报告细胞系和定量记者测定法的产生。
【背景】从历史上看，转录报告基因检测方法促进了主要信号通路的描述。具体来说，β-连环蛋白依赖性萤光素酶或基于GFP的转录报道基因有助于阐明经典Wnt /β-连环蛋白途径的分子机制（Korinek et al。，1997; Fuerer and Nusse，2010）。尽管已经描述了许多基于JNK依赖性转录的非经典Wnt信号传导报道分子，但是这些转录应答是否是非经典Wnt信号传导的主要或次要仍不清楚（Veeman等，2003; Nishita等，等，2010; Ohkawara和Niehrs，2011）。此外，用于实时检测非转录性Wnt5a-Ror信号传导事件的记者尚未获得。 ...
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| Generating Isogenic Deletions (Knockouts) in Francisella tularensis, a Highly-infectious and Fastidious Gram-negative Bacterium
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Author:
Date:
2015-06-20
[Abstract] Generating bacterial gene deletion mutants, also known as knockouts (KOs), is a powerful tool to investigate individual gene functions. However, fastidious bacteria such as Francisella tularensis (F. tularensis) often are difficult to genetically manipulate. Indeed, many different approaches have been tested to generate F. tularensis mutants. First, Tn5-based EZ::TN transposons have been successfully used to generate transposon libraries in F. tularensis (Qin and Mann, 2006; Weiss et al., 2007). However, creating a comprehensive transposon library with saturating mutations can be laborious, screening for gene disruption requires high-throughput assays where known phenotypes can be measured, and transposons may not completely inactivate the gene ...
[摘要] 产生细菌基因缺失突变体，也称为敲除（KO），是研究个别基因功能的有力工具。然而，诸如土拉弗朗西斯氏菌（emosa Francisella tularensis）（土拉弗朗西斯氏菌）之类的顽固细菌通常难以进行遗传操作。实际上，已经测试了许多不同的方法来生成F。 tularensi 的突变体。首先，基于Tn5的EZ :: TN转座子已经成功地用于在F中产生转座子文库。土耳其病（Qin and Mann，2006; Weiss等人，2007）。然而，创建具有饱和突变的综合转座子文库可能是费力的，筛选基因破坏需要高通量测定法，其中可以测量已知的表型，转座子可能不会完全失活目标基因或可能改变下游基因表达。第二，II组内含子（也称为Targetron）已用于灭活F。 （Rodriguez et al。，2008; Rodriguez et al。，2009）。 Targetron通过在质粒编码的RNA和染色体DNA之间形成复合物，随后将II组内含子插入感兴趣的基因而发挥功能。 Targetron的主要优点是它不需要抗生素抗性标记。然而，如转座子所指出的，targetron基因插入可能不能消除所有基因功能或可能影响下游基因表达。第三，同源重组可用于用选择性标记（例如抗生素抗性标记）完全替代染色体靶基因。这种经典的遗传技术已经在许多F中使用。土耳其语研究（Ramakrishnan等人，2008; ...
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