| TetR Regulated in vivo Repression Technology to Identify Conditional Gene Silencing in Genetically Engineerable Bacteria Using Vibrio cholerae Murine Infections as Model System
|
|
Author:
Date:
2020-10-05
[Abstract] Investigation of bacterial gene regulation upon environmental changes is still a challenging task. For example, Vibrio cholerae, a pathogen of the human gastrointestinal tract, faces diverse transient conditions in different compartments upon oral ingestion. Genetic reporter systems have been demonstrated to be extremely powerful tools to unravel gene regulation events in complex conditions, but so far focused mainly on gene induction. Herein, we describe the TetR-controlled recombination-based in vivo expression technology TRIVET, which allows detection of gene silencing events. TRIVET resembles a modified variant of the in vivo expression technology (IVET) as well as recombination-based in vivo expression technology (RIVET), which were used to ...
[摘要] [摘要]研究细菌基因对环境变化的调控仍然是一项艰巨的任务。例如，人胃肠道的病原体霍乱弧菌在口服后会在不同的隔室中遇到各种短暂的状况。事实证明，遗传报告系统是揭示复杂条件下基因调控事件的极有力工具，但到目前为止，它主要集中在基因诱导上。在本文中，我们描述了基于TetR控制的重组的体内表达技术TRIVET，该技术可检测基因沉默事件。TRIVET类似于体内表达技术（IVET）以及基于重组的体内变异体 表达技术（RIVET），用于鉴定宿主定殖过程中几种细菌的条件基因诱导。像它的前辈一样，TRIVET是一个基于单细胞的报告系统，可以通过耐药谱的表型变化以时空方式分析细菌基因的阻遏。简而言之，无启动子的tetR （编码转录阻遏物TetR）可通过转座子诱变随机地整合到细菌基因组中，或通过同源重组在目标启动子的下游特异性整合到细菌基因组中。的TetR导致的去阻遏的转录表达的减少的TetR控制解离TNPR，这反过来又导致切除ö F A Ñ抗生素抗性盒（也称为RES-盒）和改变的电阻曲线可观察到的通过划线上氨苄青霉素和卡那霉素板。然后可以将这种改变量化为抗性和非抗性分离株之间的比例。此外，新引入的第二报道基因，promot erless ...
|
|
|
| High-level Production of Recombinant Membrane Proteins Using the Engineered Escherichia coli Strains SuptoxD and SuptoxR
|
|
Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] We have previously described the development of two specialized Escherichia coli strains for high-level recombinant membrane protein (MP) production. These engineered strains, termed SuptoxD and SuptoxR, are capable of suppressing the cytotoxicity caused by MP overexpression and of producing greatly enhanced MP yields. Here, we present a Bio-protocol that describes gene overexpression and culturing conditions that maximize the accumulation of membrane-integrated and well-folded recombinant MPs in these strains.
[摘要] [摘要] 我们之前已经描述了两种用于生产高水平重组膜蛋白（MP）的大肠杆菌菌株的开发。这些工程菌株，称为SuptoxD和SuptoxR，能够抑制MP过度表达引起的细胞毒性，并产生显著提高的MP产量。在这里，我们提出一个生物协议，描述基因过度表达和培养条件，最大限度地积累膜整合和折叠良好的重组多磺酸粘多糖在这些菌株。
[背景]多磺酸粘多糖在所有活生物体的细胞中执行多种关键功能（Wagner et al.，2006；Schlegel et al.，2010），是当前和未来药物的主要靶点（Yildrim et al.，2007）。获得足够数量的分离蛋白是进行生化和结构研究的前提，这反过来又可以加深对其功能的理解，并发现新的MP靶向药物。
由于多磺酸粘多糖通常在其天然环境中以极低的丰度出现，异源宿主通常用于其重组过表达和随后的纯化。许多不同的系统已被用作原核和真核来源的多种多磺酸粘多糖的过表达宿主（Wagner等人，2006年）。其中，大肠杆菌是最受欢迎的一种，因为它的成本非常低，使用方便（Makino等人，2011年）。事实上，这种细菌已经成功地用于生产储存在蛋白质数据库中的所有重组产生的MP结构的大约20%（Dilworth等人，2018年）。尽管有这些优势和成功，但使用大肠杆菌作为MP生产的异源宿主通常伴随着严重的毒性、低水平的最终生物量和微小的最终产量（Miroux和Walker，1996；Wagner等人，2007；Link等人，2008；Gubellini等人，2011）。 ...
|
|
|
| Radioactive Tracer Feeding Experiments and Product Analysis to Determine the Biosynthetic Capability of Comfrey (Symphytum officinale) Leaves for Pyrrolizidine Alkaloids
|
|
Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] This protocol delivers a method to determine the biosynthetic capability of comfrey leaves for pyrrolizidine alkaloids independently from other organs like roots or flowers.
The protocol applies and combines radioactive tracer experiments with standard and modern techniques like thin layer chromatography (TLC), solid-phase extraction (SPE), high-performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).
[摘要] 该协议提供了一种方法来确定紫草叶生物合成能力的吡咯烷生物碱独立于其他器官，如根或花。
该协议将放射性示踪剂实验与薄层色谱法，固相萃取法，高效液相色谱法和气相色谱 - 质谱法等标准和现代技术相结合。
【背景】据了解，紫草根能够合成吡咯里西啶生物碱（Frölichet al。，2007），生物合成的关键酶高胡亚素合成酶（HSS）定位于内皮细胞。 除了这个合成位点之外，还有一些暗示，即某个发育阶段的叶子也许能够产生吡咯里西啶生物碱（Niemüller等人，2012）。 因此，开发一种方案来确定紫草叶合成吡咯里西啶生物碱的生物合成能力，以独立于其他植物器官。
|
|
|