| Uptake Assays to Monitor Anthracyclines Entry into Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Anthracyclines, such as doxorubicin and daunorubicin, are DNA damaging agents that autofluoresce and can be readily detected in cells. Herein, we developed suitable assays to quantify and localize daunorubicin in mammalian cells. These assays can be exploited to identify components that are involved in the uptake of anthracyclines.
[摘要] 蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，是DNA损伤剂，其可自发荧光并且可以容易地在细胞中检测到。 在这里，我们开发了合适的测定法来定量和定位哺乳动物细胞中的柔红霉素。 可以利用这些测定来鉴定参与蒽环类药物吸收的成分。
【背景】蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，通过损伤DNA起作用，用于治疗各种类型的癌症，包括急性骨髓性白血病。当癌症患者被系统地给予蒽环类抗生素时，有几个因素限制了到达肿瘤部位的药物的量（Chauncey，2001; Deng等，2014; Riganti等，2015）。在肿瘤中，对癌细胞的药物活性受到药物吸收不良，药物流出过量以及细胞靶标变化的限制。几十年来，这些DNA损伤剂如何进入癌细胞还不清楚（Aouida等，2010; Cesar-Razquin等，2015; Zhang等，2015）。为了解决这个问题，我们开发了三种可靠的体外测定法来监测柔红霉素在细胞中的积累。这些测定中的两个是定量的，需要获得荧光活化细胞分选（FACS）口径和Fluoroskan仪器，第三个是使用落射荧光显微镜进行半定量。使用这些测定法，我们确定柔红霉素以时间和浓度依赖的方式进入细胞，并且每种细胞类型显示不同的摄取速率，这表明活性过程参与蒽环类药物的摄入（Andreev等人， ...
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| Rapid Profiling Cell Cycle by Flow Cytometry Using Concurrent Staining of DNA and Mitotic Markers
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] The flow cytometric quantitation of DNA content by DNA-binding fluorochrome, propidium iodide (PI) is the most widely used method for cell cycle analysis. However, the commonly used methods are time-consuming and labor-intensive and are incompatible with staining of mitotic markers by fluorescent-labeled antibodies. Here, we report an optimized simple protocol for rapid and simultaneous analysis of characteristic mitotic phosphorylated proteins and DNA content, permitting the quantification of cells in mitosis, G1, S and G2 stage in a single assay. The protocol detailed here employs detergent-based hypotonic solution to rapidly permeabilize cells and allows simultaneous staining of DNA with PI and mitotic marker, phospho-Histone H3, with specific antibody within 20 ...
[摘要] DNA结合荧光染料，碘化丙啶（PI）对DNA含量的流式细胞定量是细胞周期分析中使用最广泛的方法。 然而，常用的方法是耗时且劳动密集的，并且与通过荧光标记的抗体对有丝分裂标记物的染色不相容。 在这里，我们报告了一个优化的简单方案，用于快速和同时分析特征有丝分裂磷酸化蛋白和DNA含量，允许在单次测定中有丝分裂，G1，S和G2期细胞的定量。 这里详述的方案采用基于洗涤剂的低渗溶液来快速透化细胞，并允许在20分钟内同时用PI和有丝分裂标记物磷酸组蛋白H3与特异性抗体染色DNA。 该方案仅需要廉价和商业可用的试剂，并且还能够快速和完整地分析细胞周期特征。
【背景】通过流式细胞术进行细胞周期分析主要基于用碘化丙啶（PI）染色测量DNA含量。 PI的化学计量特性确保DNA含量的准确定量，并且允许我们揭示G1，S和G2细胞周期阶段或G1期细胞死亡期细胞的分布，后者以DNA片段化为特征。用于基于PI的DNA定量的大多数常用方法需要使用酒精或醛固色，这是耗时且劳动密集型的。此外，这些方法与通过荧光标记的抗体对有丝分裂标记物的染色不相容。因此，我们采用和优化了以前建立的低渗缓冲液以使细胞透化，允许用PI和有丝分裂标记物磷酸组蛋白H3（pH3）同时染色DNA与pH3特异性抗体（Riccardi等人，2006; Liu et al。 ...
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| In vitro Antigen-presentation Assay for Self- and Microbial-derived Antigens
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Antigen presenting cells (APC) are able to process and present to T cells antigens from different origins. This mechanism is highly regulated, in particular by Patter Recognition Receptor (PRR) signals. Here, I detail a protocol designed to assess in vitro the capacity of APC to present antigens derived from bacteria, apoptotic and infected apoptotic cells.
[摘要] 抗原呈递细胞（APC）能够处理和呈递来自不同来源的T细胞抗原。这种机制是高度调节的，特别是通过Patter Recognition Receptor（PRR）信号。在这里，我详细说明了一种设计用于评估体外的APC方案，用于展示来源于细菌，凋亡和感染的凋亡细胞的抗原。
背景 T细胞淋巴细胞在其表面上表达T细胞受体（TCR），其允许识别作为与主要组织相容性复合物（MHC）分子结合的抗原加工和呈递的抗原的细胞（自身）或微生物（非自身）抗原）呈递细胞（APC）。 APC能够处理抗原并将其呈递给T细胞，并且MHC-TCR相互作用是感染和自身免疫应答期间T细胞活化的关键步骤。
＆NBSP;以前的作品已经描述了基于刺激模式识别受体（PRR），例如toll样受体（TLR）（Blander和Medzhitov，2004和2006）的抗原呈递的调节机制。实际上，特异性地来自含有微生物病原体的吞噬体的TLR信号有利于在MHC-II分子内呈递非自身抗原。另一方面，凋亡细胞吞噬后产生的自身抗原由于不存在TLR刺激而导致溶酶体降解。然而，当两者都来自感染的凋亡细胞并且同时由相同的吞噬体携带时，自身和非自身抗原的分离不会发生，其由针对抗原呈递的TLR信号最佳地定制。已经使用骨髓来源的树突状细胞（BMDC）和凋亡性小鼠B细胞 - ...
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