| An Affinity-directed Protein Missile (AdPROM) System for Targeted Destruction of Endogenous Proteins
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] We recently reported an Affinity-directed PROtein Missile (AdPROM) system for the targeted proteolysis of endogenous proteins of interest (POI) (Fulcher et al., 2016 and 2017). AdPROM consists of the Von Hippel Lindau (VHL) protein, a Cullin 2 E3 ligase substrate receptor (Bosu and Kipreos, 2008), conjugated to a high affinity polypeptide binder (such as a camelid nanobody) that recognises the target protein in cells. When introduced in cells, the target protein is recruited to the CUL2 E3 ubiquitin ligase complex for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. For target protein recruitment, we have utilised both camelid-derived VHH domain nanobodies as well as synthetic polypeptide monobodies based on the human type III fibronectin domain (Sha et al., 2013; Fridy et ...
[摘要] 我们最近报道了一种针对内源性感兴趣蛋白（POI）的靶向蛋白水解的亲和指导PROtein导弹（AdPROM）系统（Fulcher等人，2016和2017）。 AdPROM由Von Hippel Lindau（VHL）蛋白组成，Cullin 2 E3连接酶底物受体（Bosu and Kipreos，2008），与识别细胞中靶蛋白的高亲和力多肽结合剂（如骆驼科纳米抗体）缀合。当在细胞中引入时，靶蛋白质被招募到CUL2 E3泛素连接酶复合体用于泛素介导的蛋白酶体降解。对于靶蛋白的募集，我们使用了基于人类III型纤连蛋白结构域的骆驼科动物来源的VHH结构域纳米抗体以及合成多肽单体（Sharm等人，2013; Fridy等人。，2014; Schmidt et al。，2016）。在此协议中，我们描述了生成AdPROM构建体及其在人细胞系中用于靶蛋白质破坏的详细方法。 AdPROM允许对POI进行功能表征，并且其目标蛋白质破坏的效率克服了RNA干扰方法的许多局限性，这些方法需要长时间的治疗并与脱靶效应相关联，而CRISPR / Cas9基因编辑并不总是可行的。
【背景】该协议使人们能够在哺乳动物细胞系中设计，构建和表达AdPROM VHL-nano ...
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| Assaying the Effects of Splice Site Variants by Exon Trapping in a Mammalian Cell Line
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] There are several in silico programs that endeavor to predict the functional impact of an individual’s sequence variation at splice donor/acceptor sites, but experimental confirmation is problematic without a source of RNA from the individual that carries the variant. With the aid of an exon trapping vector, such as pSPL3, an investigator can test whether a splice site sequence change leads to altered RNA splicing, through expression of reference and variant mini-genes in mammalian cells and analysis of the resultant RNA products.
[摘要] 有几个计算机程序尝试预测个体在剪接供体/受体位点的序列变异的功能影响，但实验确认是有问题的，没有携带变体的个体的RNA来源。借助于外显子捕获载体，例如pSPL3，研究人员可以通过在哺乳动物细胞中表达参考和变体小基因来测试剪接位点序列变化是否导致改变的RNA剪接，并分析所得RNA产物。
背景 我们希望通过实验测试在TEK基因中鉴定的两个剪接供体位点变体c.760 + 2T> C和c.3300 + 2delT的功能影响（Souma等人，2016）。通常情况下，携带这些序列变体的个体不能获得细胞或mRNA的样品，因此我们利用外显子捕获方法作为功能测试。来自患者的DNA样品可用于感兴趣的基因组区域的PCR扩增。如果患者gDNA样品不可用，也可以通过诸如基于PCR的定点诱变等方法将序列变体并入野生型序列。
＆NBSP;外显子捕获方法最初是为了鉴定长期基因组DNA中的未知外显子而开发的（Duyk等人，1990）。创建了pSPL3外显子捕获载体以提高外显子鉴定的效率和可靠性，并且还允许筛选更大的基因组片段（Church et al。，1994; Nisson等，1994）。 pSPL3载体含有由SV40启动子组成的小型人造基因，具有功能性剪接供体和受体位点的外显子 - 内含子 - ...
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| Differential Salt Fractionation of Nuclei to Analyze Chromatin-associated Proteins from Cultured Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the core units of cellular chromatin and are comprised of 147 base pairs (bp) of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Proteins such as chromatin remodelers, transcription factors, and DNA repair proteins interact dynamically with chromatin to regulate access to DNA, control gene transcription, and maintain genome integrity. The extent of association with chromatin changes rapidly in response to stresses, such as immune activation, oxidative stress, or viral infection, resulting in downstream effects on chromatin conformation and transcription of target genes. To elucidate changes in the composition of proteins associated with chromatin under different conditions, we adapted existing protocols to isolate nuclei and fractionate cellular chromatin using a ...
[摘要] 核小体是细胞染色质的核心单元，由包裹在组蛋白的八聚体周围的147个碱基对（bp）的DNA组成。蛋白质如染色质重组体，转录因子和DNA修复蛋白质与染色质动态相互作用以调控DNA的接触，控制基因转录和维持基因组完整性。与染色质结合的程度响应于诸如免疫激活，氧化应激或病毒感染等应激而迅速变化，导致对染色质构象和靶基因转录的下游作用。为了阐明在不同条件下与染色质相关蛋白质组成的变化，我们调整了现有的方案来分离核，并使用盐浓度的梯度分离细胞染色质。可以通过蛋白质印迹或质谱法评估不同盐部分中特定蛋白质的存在，从而了解与染色质相关的程度。
背景 由于与DNA或组蛋白的电荷相互作用，许多染色质相关蛋白在低盐条件下是不溶的。由于盐破坏了基于电荷的蛋白质DNA和蛋白质 - 蛋白质的相互作用，染色质相关蛋白质随着NaCl浓度的增加而变得更加可溶（Teves和Henikoff，2012）。与DNA强烈结合的蛋白质预期用高盐洗脱，而松散结合的蛋白质（例如转录因子）将用低盐洗脱。我们特别关心病毒感染如何改变与细胞染色质相关的因素的组成。核复制病毒，例如腺病毒，单纯疱疹病毒和爱泼斯坦 - 巴尔病毒，可以显着改变感染期间宿主染色质的出现（Avgousti等人，2016; Lam等人， ，2010; Simpson-Holley等人，2005; ...
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