| Immunogold Localization of Molecular Constituents Associated with Basal Bodies, Flagella, and Extracellular Matrices in Male Gametes of Land Plants
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] Male gametes (spermatozoids) are the only motile cells produced during the life cycle of land plants. While absent from flowering and most cone-bearing plants, motile cells are found in less derived taxa, including bryophytes (mosses, liverworts and hornworts), pteridophytes (lycophytes and ferns) and some seed plants (Ginkgo and cycads). During development, these cells undergo profound changes that involve the production of a locomotory apparatus, unique microtubule (MT) arrays, and a series of special cell walls that are produced in sequence and are synchronized with cellular differentiation. Immunogold labeling in the transmission electron microscope (TEM) provides information on the exact location and potential function of macromolecules involved with this developmental ...
[摘要] 雄性配子（精子）是陆地植物生命周期中唯一产生的运动细胞。虽然没有开花和大多数含有锥体的植物，但在少量来源的分类群中发现运动细胞，包括苔藓植物（苔藓，苔草和horn）），蕨类植物（石膏植物和蕨类植物）和一些种子植物（银杏，苏铁）。在发育过程中，这些细胞发生深刻的变化，涉及生产运动装置，独特的微管（MT）阵列和一系列特定的细胞壁，这些细胞壁依次产生并与细胞分化同步。透射电子显微镜（TEM）中的免疫金标记提供了涉及该发育过程的大分子的确切位置和潜在功能的信息。具体而言，可能将表位定位于与涉及MT产生和功能的细胞内含物相关的蛋白质。在这些植物中的精子发生对于检查构成细胞外基质的碳水化合物和糖蛋白的差异表达也是理想的，所述细胞外基质与配子形状和运动装置发育中的戏剧性建筑变化相关。在这里我们提供使用单克隆抗体（MAbs）和透射电子显微镜中免疫金标记的方法来定位精子发育不可或缺的大分子。
【背景】动植物的陆地植物是惊人的多样化，鞭毛数量从2到4万以上（Renzaglia和Garbary，2001）。在一系列同心的有丝分裂分裂内，新生精细胞（精细胞）在一个动态和生长的细胞壁的范围内经历一系列的发育变化。当细胞器重新定位和成形时，产生复杂的运动装置并且鞭毛在细胞周围伸长。同步开发在一个单一的天竺鼠中，在一个单一的成熟阶段和不同的剖面中产生数百个细胞。
这种深刻的细胞分化涉及独特的MT阵列的发展，样条和鞭毛，从离散的微管组织中心（MTOCs），唯一含有中心粒的中心体在陆地植物散发。由于基因体，鞭毛及相关复合体在发育中的雄性配子中的独家出现，精子发生的研究揭示了MT阵列的结构，组成和发育变化的重要信息，因为它们涉及细胞周期，MTOC和细胞分化（Joshi等人，1992; ...
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| MPM-2 Mediated Immunoprecipitation of Proteins Undergoing Proline-directed Phosphorylation
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Immunoprecipitation (IP) represents a widely utilized biochemical method to isolate a specific protein from a complex mixture taking advantage of an antibody that specifically recognizes that particular target molecule. This procedure is extremely versatile and can be applied to concentrate a specific protein, to identify interacting partners in complex with it or to detect post-translational modifications. The mitotic protein monoclonal 2 (MPM-2) is an antibody originally raised against extracts of synchronized mitotic HeLa cells to identify proteins selectively present in mitotic, and not in interphase-cells (Davis et al., 1983). MPM-2 recognizes phosphorylated serine or threonine residues followed by proline (pS/T-P), consensus epitopes generated by the concerted action of ...
[摘要] 免疫沉淀（IP）代表广泛使用的生物化学方法，以利用特异性识别特定靶分子的抗体从复杂混合物中分离特异性蛋白质。该程序是非常通用的，可以应用于集中特定蛋白质，识别与其复合的相互作用的配偶体或检测翻译后修饰。有丝分裂蛋白单克隆2（MPM-2）是最初针对同步有丝分裂HeLa细胞的提取物产生的抗体，以鉴定选择性存在于有丝分裂中的蛋白质，而不是在间期细胞中（Davis等，1983）。 MPM-2识别磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基，随后是脯氨酸（pS / T-P），由脯氨酸指导的蛋白激酶和磷酸酶的共同作用产生的共有表位（Lu等，2002）。这些可逆磷酸化事件已经出现以通过促进目标上的构象变化来控制各种细胞过程，这不仅仅是由于磷酸化事件本身。这些基序一旦被磷酸化，就能够招募Pin1（肽基 - 脯氨酰异构酶NIMA相互作用蛋白1）（Lu等人，1996; Lu和Zhou，2007），这是一个促进肽键上的顺式/反式异构化反应的伴侣，在基础功能不同的构象之间切换底层（Lu，2004; Wulf等人，2005）。该方案描述了使用支架分子突触后密度蛋白-95（PSD-95）（Chen等人，2005），神经元Pin1靶（Antonelli等，2016）作为示例的基于MPM-2的免疫沉淀策略以说明详细的程序。
【背景】由MPM-2抗体识别的抗原的鉴定代表了发现经过磷酸化脯氨酰异构化调控机制的靶分子的有用起点。 ...
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| Protocol to Determine Mitotic Index by FACS
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Author:
Date:
2012-03-20
[Abstract] Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is a sensitive method to count mitotic cells. Cells are stained with an antibody that recognizes an antigen present only in mitotic cells, combined with propidium iodide (PI) to stain DNA. Two-dimensional FACS scanning allows the differential quantitation of G2 and mitotic cells. Several antibodies to different mitotic markers have been used in the community, including antibodies to MPM-2 antigens present in mitotic cells. MPM-2 recognizes a phosphorylated epitope (LTPLK or YWFSPL) 6, 7 in a distinct class of phosphoproteins including MAP2, HSP70, cdc25, and DNA topoisomerase IIα, most of which are phosphorylated at the onset of mitosis. The commercial availability and specificity of antibodies to histone H3 phosphorylated at threonine 11, which ...
[摘要] 荧光活化细胞分选（FACS）是一种计数有丝分裂细胞的敏感方法。 细胞用识别仅存在于有丝分裂细胞中的抗原的抗体染色，与碘化丙啶（PI）组合染色DNA。 二维FACS扫描允许差异定量G2和有丝分裂细胞。 已经在社区中使用了针对不同有丝分裂标记物的几种抗体，包括针对有丝分裂细胞中存在的MPM-2抗原的抗体。 MPM-2识别不同类别的磷酸化蛋白中的磷酸化表位（LTPLK或YWFSPL）6,7，所述磷酸化蛋白包括MAP2，HSP70，cdc25和DNA拓扑异构酶IIα，其中大多数在有丝分裂发生时被磷酸化。 在仅存在于有丝分裂细胞中的苏氨酸11磷酸化的组蛋白H3的抗体的商业可用性和特异性也已广泛用于检测有丝分裂细胞。
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