| Hair Follicle Stem Cell Isolation and Expansion
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Stem cells are widely used for numerous clinical applications including limbal stem cell deficiency. Stem cell derived from the bulge region of the hair follicle have the ability to differentiate into a variety of cell types including interfollicular epidermis, hair follicle structures, sebaceous glands and corneal epithelial cells when provided the appropriate cues. Hair follicle stem cells are being studied as a valuable source of autologous stem cells to treat disease. The protocol described below details the isolation and expansion of these cells for eventual clinical application. We used a dual-reporter mouse model to visualize both isolation and eventual differentiation of these cells in a limbal stem cell-deficient mouse model.
[摘要] 干细胞被广泛用于许多临床应用，包括角膜缘干细胞缺陷。 当提供适当的提示时，源自毛囊凸出区域的干细胞具有分化成多种细胞类型的能力，包括滤泡间表皮，毛囊结构，皮脂腺和角膜上皮细胞。 正在研究毛囊干细胞作为自体干细胞治疗疾病的宝贵来源。 下面描述的方案详细描述了这些细胞的最终临床应用的分离和扩增。 我们使用双报告小鼠模型来观察这些细胞在角膜缘干细胞缺陷小鼠模型中的分离和最终分化。
【背景】干细胞被广泛用于多种翻译和临床应用。一种这样的临床应用是用于治疗角膜缘干细胞缺陷（LSCD）。当角膜缘干细胞群存在功能障碍或丧失时，LSCD发生，这对于由于先天性或获得性病理而维持健康的眼表非常重要。 LSCD的主要治疗策略是从患者健康眼睛的角膜缘活检组织培养自体上皮细胞片（Pellegrini等人，1997; Shortt等人，2007） 。这种策略的局限性在于它只适用于患有单侧LSCD的患者。那些有双侧LSCD的患者必须依靠免疫相关活体供体或尸体组织的同种异体角膜缘活检。由于全身性免疫抑制治疗的需要和供体组织的有限可用性，治疗成功率降低。一些研究小组一直在研究使用培养的口腔粘膜细胞治疗LSCD并取得了一些成功。然而，这些细胞通常不能表达角膜上皮分化标记角蛋白12（Inatomi等，2006），并且经常导致外周血管新生的发展（Nakamura等人， ，2004; ...
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| Murine Hair Follicle Derived Stem Cell Transplantation onto the Cornea Using a Fibrin Carrier
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The goal of this protocol is to establish a procedure for cultivating stem cells on a fibrin carrier to allow for eventual transplantation to the eye. The ability to transfer stem cells to a patient is critical for treatment for a variety of disorders and wound repair. We took hair follicle stem cells from the vibrissae of transgenic mice expressing a dual reporter gene under the control of the Tet-on system and the keratin 12 promoter (Meyer-Blazejewska et al., 2011). A clonal growth assay was performed to enrich for stem cells. Once holoclones formed they were transferred onto a fibrin carrier and cultivated to obtain a confluent epithelial cell layer. Limbal stem cell deficient (LSCD) mice were used as the transplant recipient in order to test for successful grafting and ...
[摘要] 该方案的目标是建立一种在纤维蛋白载体上培养干细胞以允许最终移植到眼睛的程序。 将干细胞转移给患者的能力对于治疗各种疾病和伤口修复至关重要。 我们在Tet-on系统和角蛋白12启动子（Meyer-Blazejewska等人，2011）的控制下从表达双报告基因的转基因小鼠的触须中取出毛囊干细胞。 进行克隆生长测定以富集干细胞。 一旦形成holoclones，将它们转移到纤维蛋白载体上并培养以获得融合上皮细胞层。 将角膜缘干细胞缺陷（LSCD）小鼠用作移植受体以测试移植成功和最终分化为角膜上皮表型。
【背景】干细胞被广泛用作治疗工具，因此递送手段是必不可少的。实际上，许多研究人员和公司正在寻找将细胞输送到人体内以优化细胞存活以及整合到宿主组织中的最佳方式。注射方法已广泛用于动物模型，但往往导致生存和整合差。目前正在使用利用生物材料和手术装置的技术。一种用于输送干细胞的技术是纤维蛋白载体。纤维蛋白凝胶是可降解的生物聚合物，其可粘附于允许细胞附着，迁移和增殖的天然组织（Ehrbar et al。，2005）。纤维蛋白凝胶具有许多优点，包括生物相容性，受控降解（Kjaergard等人，1994; Sidelmann等人，2000），均匀细胞分布和高细胞接种效率（Swartz ，2005）。已经将纤维蛋白凝胶用于治疗皮肤烧伤（Pellegrini等人，1999; ...
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| Heterochronic Pellet Assay to Test Cell-cell Communication in the Mouse Retina
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] All seven retinal cell types that make up the mature retina are generated from a common, multipotent pool of retinal progenitor cells (RPCs) (Wallace, 2011). One way that RPCs know when sufficient numbers of particular cell-types have been generated is through negative feedback signals, which are emitted by differentiated cells and must reach threshold levels to block additional differentiation of that cell type. A key assay to assess whether negative feedback signals are emitted by differentiated cells is a heterochronic pellet assay in which early stage RPCs are dissociated and labeled with BrdU, then mixed with a 20-fold excess of dissociated differentiated cells. The combined cells are then re-aggregated and cultured as a pellet on a membrane for 7-10 days in vitro. During ...
[摘要] 构成成熟视网膜的所有七种视网膜细胞类型都是由普通的多能视网膜祖细胞池（RPC）产生的（Wallace，2011）。已经产生足够数量的特定细胞类型的RPC知道的一种方式是通过负反馈信号，其由分化细胞发射并且必须达到阈值水平以阻止该细胞类型的额外分化。评估负反馈信号是否由分化细胞发出的关键测定是异源沉淀测定，其中早期RPC被解离并用BrdU标记，然后与20倍过量的解离的分化细胞混合。然后将组合的细胞再次聚集并在细胞膜上培养7-10天。在这段时间内，RPC将会分化，BrdU + RPC的命运可以使用细胞类型特异性标记进行评估。开发这种沉淀测定的研究人员最初表明，当两种细胞类型混合在一起时，新生儿RPC与胚胎RPC相比，在加速进度条件下产生杆（Watanabe和Raff，1990; Watanabe等，1997）。我们已经使用这种测定来证明我们发现作为视网膜神经节细胞（RGC）分化的负调节物的声刺猬（Shh）促进RPC增殖（Jensen和Wallace，1997; Ringuette等，2014）。最近我们修改了异质性沉淀测定法，以评估视网膜无长突细胞的反馈信号的作用，将转化生长因子β2（Tgfβ2）鉴定为负反馈信号，并将Pten作为Tgfβ2应答的调节剂（Ma et al。，2007 ; ...
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