| Induction of Natural Competence in Genetically-modified Lactococcus lactis
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Natural competence can be activated in Lactoccocus lactis subsp lactis and cremoris upon overexpression of ComX, a master regulator of bacterial competence. Herein, we demonstrate a method to activate bacterial competence by regulating the expression of the comX gene by using a nisin-inducible promoter in an L. lactis strain harboring either a chromosomal or plasmid-encoded copy of nisRK. Addition of moderate concentrations of the inducer nisin resulted in concomitant moderate levels of ComX, which led to an optimal transformation rate (1.0 x 10-6 transformants/total cell number/g plasmid DNA). Here, a detailed description of the optimized protocol for competence induction is presented.
[摘要] 在过度表达细菌能力的主要调节因子ComX后，天然能力可以在乳酸乳球菌亚种乳酸和 cremoris 中激活。 在本文中，我们展示了通过在 L中使用乳链菌肽诱导型启动子调节 comX 基因的表达来激活细菌能力的方法。 含有 nisRK 的染色体或质粒编码拷贝的lactis 菌株。 加入中等浓度的诱导剂乳链菌肽导致伴随的中等水平的ComX，其导致最佳转化率（1.0×10 2 sup / -6>转化子/总细胞数/ g质粒DNA）。 在此，提出了用于能力归纳的优化协议的详细描述。
【背景】自然能力是细菌通过专门的摄取机制获得外源DNA的过程，之后内化的DNA整合到其基因组中或作为质粒DNA维持。一些细菌在特定的环境触发因素如基因毒性应激或饥饿时进入能力状态（Seitz和Blokesch，2013; Blokesch，2016）。群体感应系统，如 comCDE 或 comRS ，控制着革兰氏阳性菌的自然能力的激活（Håvarstein et al。，1995; Pestova et al。，1996; Kleerebezem et al。，1997b; Fontaine et al。，2015）。更具体地说， comC 和 comS 编码信息素，而 comD 编码组氨酸激酶和 comE 和 comR 编码响应调节器（Håvarstein et al。，1995; ...
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| RNA Strand Displacement Assay for Hepatitis E Virus Helicase
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The hepatitis E virus (HEV) helicase uses ATP to unwind the RNA duplexes. This is an essential step for viral replication. This protocol aims to measure the double strand RNA unwinding activity of the HEV helicase.
[摘要] 乙型肝炎病毒（HEV）解旋酶使用ATP来解开RNA双链体。 这是病毒复制的重要步骤。 该方案旨在测量HEV解旋酶的双链RNA展开活性。
已经使用放射性标记的双链RNA（dsRNA，Karpe等人，2010）测量了HEV解旋酶的RNA展开活性。 我们已经建立了用于测量HEV解旋酶的dsRNA展开活性的非放射性测定方案。 该测定利用荧光标记的RNA来测量从人肝癌细胞纯化的HEV解旋酶蛋白的活性，从而消除了处理放射性物质的需要。
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| RNA-dependent RNA Polymerase Assay for Hepatitis E Virus
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) is essential for the replication of viral RNA for RNA viruses. It synthesizes the complementary strand of viral genomic RNA, which is used subsequently as a template to generate more copies of viral genome. This assay measures activity of the hepatitis E virus (HEV) RdRp. In contrast to protocols available to assay the RdRp activity of many other viruses, this assay utilizes DIG-11-UTP as a nonradioactive alternative to 32P-UTP, thereby increasing the convenience of performing the assay.
[摘要] RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）对RNA病毒的病毒RNA的复制至关重要。 它合成病毒基因组RNA的互补链，其随后用作模板以产生更多的病毒基因组拷贝。 该测定法测定戊型肝炎病毒（HEV）RdRp的活性。 与可用于测定许多其他病毒的RdRp活性的方案相比，该测定法使用DIG-11-UTP作为32P-UTP的非放射性替代物，从而增加了进行测定的便利性。
没有测定可测量HEV RdRp的活性。 已经使用放射性标记的核苷酸（Behrens等人，1996）在少数其他病毒如丙型肝炎病毒中测量了RdRp活性。 我们已经调整了Behrens等人所描述的协议。 （1996），并将其修饰为建立非放射性测定方案，其依赖于将DIG-11-UTP掺入反义RNA链中作为HEV RdRp的活性的量度。 该测定使用体外合成的病毒RNA片段作为模板，以使用基于化学发光的策略来测量从人肝癌细胞纯化的HEV RdRp蛋白的活性。
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