| Assessment of Modulation of Protein Stability Using Pulse-chase Method
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Pulse-chase technique is a method widely used to assess protein or mRNA stability. The principle of pulse-chase relies on labeling proteins or mRNA produced during a short period of time called ‘pulse’ and then following the rate of disappearance of those labeled proteins over a period of time called ‘chase’. This technique thus allows quantitative analysis of modulation of protein or mRNA stability under different treatments or culturing conditions.
[摘要] 脉冲追踪技术是广泛用于评估蛋白质或mRNA稳定性的方法。 脉冲追踪的原理依赖于在短时间内产生的称为“脉冲”的蛋白质或mRNA的标记，然后遵循称为“追逐”的时间段内那些标记蛋白质的消失速率。 因此，该技术允许在不同处理或培养条件下对蛋白质或mRNA稳定性的调节进行定量分析。
【背景】脉冲追踪技术是一种方法，其涉及在称为“脉冲”的短时间内在含有标记氨基酸的培养基中培养细胞。这导致结合标记的氨基酸的新合成的多肽的产生。脉冲步骤之后是“追逐”步骤，其中洗涤标记培养基以终止标记过程，并被具有非标记氨基酸的培养基代替，以允许在任何给定时间定量初始合成的放射性标记的蛋白质在这个追逐阶段。因此，该技术可以及时地从合成到降解的方法定量分析感兴趣的蛋白质的加工。脉冲追踪方法可用于分析蛋白质折叠，共翻译修饰和细胞内运输等各种过程（Jansens和Braakman 2003;Magadán，2014）。然而，脉冲追踪技术最常用于评估不同实验条件下蛋白质的稳定性。
放射性是常用的标签。标签通常用于使用放射性S35甲硫氨酸的蛋白质。放射性标记的蛋白质的消失动力学依赖于这些蛋白质降解的速度，可以用来检验不同实验条件对蛋白质稳定性的影响。为了评估特定目的蛋白质的稳定性，该蛋白质在使用特异性抗体在脉冲期间产生的所有其它免疫标记的蛋白质免疫沉淀。免疫沉淀将分离在脉冲期间产生并且直到免疫沉淀时尚未降解的放射性标记的蛋白质的比例。然后测量放射性以评估标记蛋白质在一段时间内的相对量。 ...
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| MPM-2 Mediated Immunoprecipitation of Proteins Undergoing Proline-directed Phosphorylation
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Immunoprecipitation (IP) represents a widely utilized biochemical method to isolate a specific protein from a complex mixture taking advantage of an antibody that specifically recognizes that particular target molecule. This procedure is extremely versatile and can be applied to concentrate a specific protein, to identify interacting partners in complex with it or to detect post-translational modifications. The mitotic protein monoclonal 2 (MPM-2) is an antibody originally raised against extracts of synchronized mitotic HeLa cells to identify proteins selectively present in mitotic, and not in interphase-cells (Davis et al., 1983). MPM-2 recognizes phosphorylated serine or threonine residues followed by proline (pS/T-P), consensus epitopes generated by the concerted action of ...
[摘要] 免疫沉淀（IP）代表广泛使用的生物化学方法，以利用特异性识别特定靶分子的抗体从复杂混合物中分离特异性蛋白质。该程序是非常通用的，可以应用于集中特定蛋白质，识别与其复合的相互作用的配偶体或检测翻译后修饰。有丝分裂蛋白单克隆2（MPM-2）是最初针对同步有丝分裂HeLa细胞的提取物产生的抗体，以鉴定选择性存在于有丝分裂中的蛋白质，而不是在间期细胞中（Davis等，1983）。 MPM-2识别磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基，随后是脯氨酸（pS / T-P），由脯氨酸指导的蛋白激酶和磷酸酶的共同作用产生的共有表位（Lu等，2002）。这些可逆磷酸化事件已经出现以通过促进目标上的构象变化来控制各种细胞过程，这不仅仅是由于磷酸化事件本身。这些基序一旦被磷酸化，就能够招募Pin1（肽基 - 脯氨酰异构酶NIMA相互作用蛋白1）（Lu等人，1996; Lu和Zhou，2007），这是一个促进肽键上的顺式/反式异构化反应的伴侣，在基础功能不同的构象之间切换底层（Lu，2004; Wulf等人，2005）。该方案描述了使用支架分子突触后密度蛋白-95（PSD-95）（Chen等人，2005），神经元Pin1靶（Antonelli等，2016）作为示例的基于MPM-2的免疫沉淀策略以说明详细的程序。
【背景】由MPM-2抗体识别的抗原的鉴定代表了发现经过磷酸化脯氨酰异构化调控机制的靶分子的有用起点。 ...
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| Protein Extraction from Mice Xenograft Tumor
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Author:
Date:
2012-04-05
[Abstract] Proteins from frozen tissue such as xenograft tumor need to be extracted efficiently without being degraded to make the best use of a limited resource and to ensure that an accurate representation of proteins in selected tumor tissue can be obtained. This protocol describes how to extract proteins from xenograft tumors in mice.
[摘要] 腺病毒是有效的基因递送系统。 用于纯化腺病毒载体的标准方法基于使用氯化铯（CsCl）密度梯度与超速离心的组合。 该方法适合于小规模纯化，并且比柱层析或商业纯化试剂盒更便宜。...
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