| Probe-Seq: Method for RNA Sequencing of Specific Cell Types from Animal Tissue
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Most organs and tissues are composed of many types of cells. To characterize cellular state, various transcription profiling approaches are currently available, including whole-tissue bulk RNA sequencing, single cell RNA sequencing (scRNA-Seq), and cell type-specific RNA sequencing. What is missing in this repertoire is a simple, versatile method for bulk transcriptional profiling of cell types for which cell type-specific genetic markers or antibodies are not readily available. We therefore developed Probe-Seq, which uses hybridization of gene-specific probes to RNA markers for isolation of specific types of cells, to enable downstream FACS isolation and bulk RNA sequencing. We show that this method can enable isolation and profiling of specific cell types from mouse retina, frozen human ...
[摘要] [摘要 ] 大多数器官和组织由许多类型的细胞组成。为了表征细胞状态，目前可以使用各种转录分析方法，包括全组织体RNA测序，单细胞RNA测序（scRNA -Seq）和特定于细胞类型的RNA测序。在此库中缺少的是一种简单，通用的方法，无法批量获得细胞类型的特定基因标记或抗体，因此无法批量转录。因此，我们开发了Probe-Seq，该探针使用基因特异性探针与RNA标记的杂交来分离特定类型的细胞，以实现下游FACS分离和大量RNA测序。我们表明，该方法可以实现从小鼠视网膜，冷冻人视网膜，果蝇中肠和发育中的雏鸡视网膜中分离和分析特定细胞类型的特征，这表明它对大多数生物很有用。
[背景技术 [ 0002 ] 在过去的二十年中，使用RNA-Seq和微阵列进行转录谱分析已在生物学研究中无处不在。分析现在是用来了解大多数生物体中细胞和细胞状态的主要工具之一。它被用于正常发育，异常发育和疾病的研究，并极大地扩展了我们对进化关系的理解。特别地，scRNA- Seq已经以前所未有的速度导致了新型细胞类型的鉴定（Picelli 等，2013；Jaitin 等，2014； Klein 等，2015； Macosko 等，2015）。为了更深入地了解这些新描述的细胞类型，一种无需转基因标记或特异性抗原即可将其分离的方法将大有裨益。尽管可以使用scRNA ...
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| Studying the Mechanisms of Developmental Vocal Learning and Adult Vocal Performance in Zebra Finches through Lentiviral Injection
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Here we provide a detailed step-by-step protocol for using lentivirus to manipulate miRNA expression in Area X of juvenile zebra finches and for analyzing the consequences on song learning and song performance. This protocol has four parts: 1) making the lentiviral construct to overexpress miRNA miR-9; 2) packaging the lentiviral vector; 3) stereotaxic injection of the lentivirus into Area X of juvenile zebra finches; 4) analysis of song learning and song performance in juvenile and adult zebra finches. These methods complement the methods employed in recent works that showed changing FoxP2 gene expression in Area X with lentivirus or adeno-associated virus leads to impairments in song behavior.
[摘要] 在这里，我们提供了一个详细的逐步协议，用于使用慢病毒操纵幼年斑胸草雀X区的miRNA表达，并分析对歌曲学习和歌曲表现的影响。 该方案有四个部分：1）使慢病毒构建体过表达miRNA miR-9; 2）包装慢病毒载体; 3）将慢病毒立体定位注入少年斑胸草雀X区; 4）青少年和成年斑马雀的歌曲学习和歌曲表演分析。 这些方法补充了近期工作中使用的方法，这些方法显示，在区域X中用慢病毒或腺相关病毒改变 FoxP2 基因表达导致歌曲行为的损害。
【背景】具有良好特征的歌曲行为和基础神经回路的斑胸草雀提供了独特的动物模型来研究声音通信和相关感觉 - 运动学习的神经机制。近年来，一些实验室开始使用病毒载体来操纵斑胸草雀脑中的基因表达并研究其功能后果。这些努力通过对 FoxP2 基因的研究得到了最好的说明，该基因编码叉头盒p2转录因子。 FoxP2蛋白控制着数百个在神经系统发育中起重要作用的下游基因的表达。人类 FoxP2 基因的突变导致言语和语言障碍（Lai et al。，2001）。在鸣禽中，斑马雀X区域的 FoxP2 基因的敲除或过表达，对于声乐学习至关重要的基底神经节核，严重损害了歌曲的行为（Haesler et al。， 2007; Murugan et al。，2013; Heston and ...
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| Hypoxia Reporter Element Assay
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Hypoxia is a condition in which there is a decrease in oxygen supply to the cellular environment. Changes to cellular oxygen levels can lead to transcriptional changes of oxygen-regulated genes. Reporter assays are used to study gene expression alteration and modifications in response to environmental changes. Dual-reporter assays allow the simultaneous measurement of two different genes within a single cell, thus improving experimental accuracy. Within this protocol, we describe the utilization of the LightSwitch Dual Assay System to measure BMX expression in response to hypoxic conditions.
[摘要] 缺氧是细胞环境中氧供应减少的一种情况。 细胞氧水平的变化可导致氧调节基因的转录变化。 报告分析用于研究响应环境变化的基因表达改变和修饰。 双报告分析允许同时测量单个细胞内的两个不同基因，从而提高实验准确性。 在该协议中，我们描述了LightSwitch双重测定系统的使用，以测量响应缺氧条件的BMX表达。
【背景】在我们最近的出版物（van Oosterwijk et al。，2018）中，我们试图检测BMX（一种非受体酪氨酸激酶）对索拉非尼治疗的反应。 BMX是一种Tec激酶家族成员，已知与酪氨酸磷酸化蛋白结合并通过与磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸结合而介导膜靶向（PIP3; Chen 等人，2013）。我们发现索拉非尼在有或没有基质细胞支持的急性髓性白血病（AML）细胞系中的直接治疗对BMX的上调没有贡献。以前的研究表明缺血可诱导BMX表达，索拉非尼具有抗血管生成活性（He et al。，2006; Davis et al。，2011）。因此，我们假设索拉非尼的抗血管生成活性导致骨髓内的缺氧环境，从而导致AML中缺氧依赖性BMX上调。在缺氧条件下，我们能够显示许多不同细胞系中BMX表达的显着增加。 BMX启动子的进一步分析在-5005处鉴定出推定的缺氧反应元件（HRE; ...
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