| Microglial Phagocytosis Assay
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Phagocytosis is essential for microglial clearance of apoptotic cells, extracellular protein aggregates, and infectious bacteria in the central nervous system (CNS). While the preparation of primary microglial culture has been described elsewhere, this protocol describes the microglial phagocytosis experimental procedure and the subsequent measurement of microglial phagocytic ability using fluorescent latex beads or fluorescent amyloid beta 42 (Aβ42) peptides.
[摘要] 吞噬作用对于中枢神经系统（CNS）中细胞凋亡细胞，细胞外蛋白质聚集体和感染性细菌的小胶质细胞清除至关重要。 虽然其他地方已经描述了原代小胶质细胞培养物的制备，但是该方案描述了小胶质细胞吞噬实验程序和随后使用荧光乳胶珠或荧光淀粉样蛋白β42（Aβ42）肽测量小胶质细胞吞噬能力。
【背景】小神经胶质细胞在中枢神经系统（CNS）中起多重作用。刺激后，小胶质细胞呈现复杂的炎症反应，包括改变的基因表达和形态变化（Heneka等，2014; Cunningham，2013）。细胞因子是通过活化的小胶质细胞改变的表达分子列表中的关键的蛋白质簇。通过在星形胶质细胞，神经元和其他脑细胞类型上表达的有效的信号传导能力的细胞因子受体，小胶质细胞传达，募集和协调炎性事件（Smith等，2012）。除了细胞因子分泌，吞噬细胞，其涉及小胶质细胞的形态学变化，也增加了他们作为CNS环境中环境稳态监护人的作用。病原体的小胶质细胞吞噬作用，细胞外蛋白质聚集体和凋亡细胞碎片抑制炎症和保护神经元（Fu et al。，2014）。除致病条件外，小神经胶质细胞吞噬也通过消除非功能性突触参与CNS发育和突触发生。缺乏或过量的小神经胶质细胞吞噬能力可导致突触连接异常和聚集蛋白沉积（Schafer et al。，2012; Lian et ...
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| Protocol for Primary Microglial Culture Preparation
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Primary microglia, in either mono-culture or co-culture with neurons or astrocytes, are a powerful tool for studying mechanisms underlying microglial inflammatory responses and cell type-specific interactions in the central nervous system (CNS). This protocol provides the details of how to prepare high purity primary microglia from newborn mouse pups. The overall steps include brain cell dissociation, mixed glial cell culture, and microglia isolation.
[摘要] 单细胞培养或与神经元或星形胶质细胞共培养的原代小胶质细胞是研究中枢神经系统（CNS）中小胶质细胞炎症反应和细胞类型特异性相互作用的机制的有力工具。 该方案提供了如何从新生小鼠幼崽准备高纯度小胶质细胞的细节。 总体步骤包括脑细胞解离，混合胶质细胞培养和小胶质细胞分离。
【背景】近年来，神经炎症已成为神经科学研究的热点领域。在各种神经系统疾病患者的脑中观察到炎症反应，如胶质细胞激活和细胞因子上调（Fan等，2015; Koshimori等，2015; Garden and Campbell，2016）。神经炎症不仅被认为是脑内病理变化的结果，而且也是疾病进展的贡献者（Schwartz等，2013）。此外，炎症途径的生理功能，其重要性以前被低估，正在被揭示为令人惊讶的多才多艺。例如，补体信号通路的激活通常在神经系统疾病中的中枢神经系统（CNS）中被观察到，并被怀疑参与疾病病理生理学（Michailidou等人，2015; Loeffler等人，2008）。现在我们知道它也在突触细化发育调控中发挥重要作用（Stevens et ...
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| RAB21 Activity Assay Using GST-fused APPL1
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Author:
Date:
2016-02-20
[Abstract] The Rab family of small GTPases are essential regulators of membrane trafficking events. As with other small GTPase families, Rab GTPases cycle between an inactive GDP- bound state and an active GTP-bound state. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) promote Rab activation with the exchange of bound GDP for GTP, while GTPase-activating proteins (GAPs) regulate Rab inactivation with GTP hydrolysis. Numerous methods have been established to monitor the activation status of Rab GTPases. Of those, FRET-based methods are used to identify when and where a Rab GTPase is activated in cells. Unfortunately, the generation of such probes is complex, and only a limited number of Rabs have been probed this way. Biochemical purification of activated Rabs from cell or tissue extracts is easily ...
[摘要] 小GTP酶的Rab家族是膜运输事件的必要调节剂。与其他小GTP酶家族一样，Rab GTP酶在不活动的GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）促进Rab激活与交换绑定GDP GTP，而GTPase激活蛋白（GAP）调节Rab失活与GTP水解。已经建立了许多方法来监测Rab GTPases的活化状态。其中，基于FRET的方法用于鉴定细胞中Rab GTPase在何时和何地被激活。不幸的是，这种探针的产生是复杂的，并且只有有限数量的Rab已经以这种方式探测。来自细胞或组织提取物的活化的Rabs的生物化学纯化通过使用已知的Rab效应结构域以下拉特定的GTP结合的Rab形式是容易实现的。虽然这种方法不是理想的详细的亚细胞定位，它可以提供Rab活动的时间分辨率。越来越多的特异性效应物的鉴定现在允许在特定条件下测试许多Rab GTP酶的活化水平。在这里，我们描述了一种亲和纯化方法使用GST融合APPL1（一种已知的RAB21效应）来测试哺乳动物细胞中的RAB21激活。该方法成功地用于测定RAB21激活状态下营养丰富与饥饿条件下的变化，并测试在此过程中MTMR13 RAB21 GEF的需求。
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