| Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) for Studying Sarcomeric Protein Interactions in Drosophila
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Protein-protein interactions in Drosophila myofibrils are essential for their function and formation. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an effective method for studying protein interactions and localization. BiFC relies on the reconstitution of a monomeric fluorescent protein from two half-fragments when in proximity. Two proteins tagged with the different half-fragments emit a fluorescent signal when they are in physical contact, thus revealing a protein interaction and its spatial distribution. Because myofibrils are large networks of interconnected proteins, BIFC is an ideal method to study protein-protein interactions in myofibrils. Here we present a protocol for generating transgenic flies compatible with BiFC and a method for analyzing protein-protein ...
[摘要] [摘要] 果蝇肌原纤维中的蛋白质-蛋白质相互作用对其功能和形成至关重要。双分子荧光互补（BiFC ）是研究蛋白质相互作用和定位的一种有效方法。BiFC 依赖于邻近时从两个半片段重构单体荧光蛋白。标记有不同半片段的两种蛋白质在物理接触时会发出荧光信号，从而揭示了蛋白质相互作用及其空间分布。因为肌原纤维相互连接的蛋白质的大型网络中，附设是一种理想的方法来 研究肌原纤维中蛋白质之间的相互作用。在这里，我们提出了一种生成与BiFC 兼容的转基因果蝇的协议，以及一种基于肌原纤维中荧光BiFC 信号的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法。我们的方案适用于大多数果蝇蛋白，只需稍加修改即可用于研究任何组织。
[背景] 肉瘤是横纹肌中最小的收缩单位，并沿着肌原纤维的长度以重复的方式延伸（Reedy和Beall，1993）。肉瘤产生肌肉收缩的能力取决于两个肌原纤维成分：细丝和粗丝。肌球蛋白粗丝固定在肌节中心的M线，而肌动蛋白细丝固定在肌节两侧的Z盘上。因此，Z盘对于维持肌原纤维的结构和收缩至关重要，而Z盘无法形成可能导致各种人类肌病的严重缺陷性肌肉表型（Lemke和Schnorrer，2017年）。
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| Formalin Murine Model of Pain
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Pain research is mostly based on experimental assays that use animal models, which may allow deciphering the physiopathology of this condition and to propel drug discovery. The formalin nociception test is considered one of the most predictive approaches to study acute pain in rodents. This test permits monitoring pain-related responses (i.e., itch) caused by a subcutaneous injection of an inflammatory agent, namely 2.5% formalin solution, in the hind paw. After the injection, two distinct time periods or phases of licking/biting behaviour occur, which are separated by a quiescent period. Importantly, these phases differ in duration and underlying mechanisms. Hence, the initial acute phase (phase I), commonly recorded for 5 min just after formalin administration, reflects acute ...
[摘要] 疼痛研究主要基于使用动物模型的实验分析，这可能允许破译这种病症的病理生理学并推动药物发现。福尔马林伤害感受测试被认为是研究啮齿动物急性疼痛的最有预见性的方法之一。该测试允许监测由后部皮下注射炎症剂，即2.5％福尔马林溶液引起的疼痛相关反应（即，瘙痒）。注射后，发生两个不同的舔/咬行为的时间段或阶段，这些时段或阶段由静止期隔开。重要的是，这些阶段的持续时间和基本机制不同。因此，通常在福尔马林给药后5分钟记录的初始急性期（阶段I）反映了急性外周疼痛，可能是由于通过TRPA1通道直接激活伤害感受器。另一方面，在静止期（5-15分钟）后开始并且通常记录15-30分钟的阶段II是由于正在进行的炎症输入和中枢伤害性敏化。在这里，我们详细描述了用于在小鼠中进行可靠和可重复的福尔马林测试的方案。
【背景】福尔马林试验是允许确定小鼠伤害行为的实验分析。因此，通常在足底后爪（Tjolsen等人，1992）中皮下注射福尔马林后评估小鼠反应（即，舔and和退缩）。该试验最初是在七十年代后期描述的（Dubuisson和Dennis，1977），最初是由一只老鼠或一只猫的前爪背面注射50μl5％福尔马林组成的。此后，福尔马林试验已经被广泛用于评估伤害感受和炎症相关反应，因此根据每项研究的目的进行调整。小鼠和大鼠由于天生的梳理行为而经常使用（即，前爪舔）。因此，注射到啮齿动物后爪中足底表面的2.5％福尔马林（在生理盐水溶液中）通常用于诱导伤害性反应（即，爪，'退缩'和舔）持续45-90分钟（Tjolsen等人，1992）。 ...
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| Trimolecular Fluorescence Complementation (TriFC) Assay for Direct Visualization of RNA-Protein Interaction in planta
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] RNA-Protein interactions play important roles in various eukaryotic biological processes. Molecular imaging of subcellular localization of RNA/protein complexes in plants is critical for understanding these interactions. However, methods to image RNA-Protein interactions in living plants have not yet been developed until now. Recently, we have developed a trimolecular fluorescence complementation (TriFC) system for in vivo visualization of RNA-Protein interaction by transient expression in tobacco leaves. In this method, we combined conventional bimolecular fluorescence complementation (BiFC) system with MS2 system (phage MS2 coat protein [MCP] and its binding RNA sequence [MS2 sequence]) (Schonberger et al., 2012). Target RNA is tagged with 6xMS2 and MCP and RNA binding ...
[摘要] RNA-蛋白质相互作用在各种真核生物过程中起重要作用。 RNA /蛋白质复合物在植物中亚细胞定位的分子成像对于理解这些相互作用至关重要。然而，到目前为止，尚未开发在活植物中形成RNA-蛋白质相互作用的方法。最近，我们开发了一种三分子荧光互补（TriFC）系统，用于在烟草叶中瞬时表达的RNA-蛋白质相互作用的体内可视化。在这种方法中，我们将传统的双分子荧光互补（BiFC）系统与MS2系统（噬菌体MS2外壳蛋白[MCP]及其结合RNA序列[MS2序列]）（Schonberger等人，2012）相结合， 。目标RNA用6xMS2标记，MCP和RNA结合蛋白与YFP片段融合。编码这种融合RNA和蛋白质的DNA构建体用土壤杆菌悬浮液渗入烟草叶中。通过共焦显微镜观察体内的RNA-蛋白质相互作用
【背景】近来，多种类型的长非编码RNA（lncRNA）已经被鉴定并显示出在转录调节和染色质修饰中起重要作用（St Laurent等人，2015）。到目前为止，lncRNA介导的功能的大多数分子机制与RNA-蛋白质相互作用密切相关（St ...
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