| FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] We developed a protocol for photoconversion of endocytic marker FM1-43 followed by electron microscopy analysis of synaptic boutons at the Drosophila neuromuscular junction. This protocol allows detection of stained synaptic vesicle even when release rates are very low, such as during the spontaneous release mode. The preparations are loaded with the FM1-43 dye, pre-fixed, treated and illuminated to photoconvert the dye, and then processed for conventional electron microscopy. This procedure enables clear identification of stained synaptic vesicles at electron micrographs.
[摘要] 我们开发了内吞标记FM1-43的光转换方案，然后在果蝇神经肌肉接头处进行突触引物的电子显微镜分析。 即使在释放速率非常低时，例如在自发释放模式期间，该方案允许检测染色的突触小泡。 该制剂装载有FM1-43染料，经预先固定，处理和照射，以使染料转变为染料，然后进行常规电子显微镜处理。 该方法能够在电子显微照片下清楚鉴定染色的突触小泡。
【背景】神经元发射体通过突触小泡与神经元质膜的融合而释放。囊泡可以自发融合或响应动作电位。随后，囊泡通过内吞作用获得回收。通过分子生物学，电生理学和显微镜的工具广泛研究了突触小泡回收的分子机制（Slepnev和De Camilli，2000; Sudhof，2004; Rizzoli和Betz，2005; Kavalali，2006）。加载内参标记FM1-43与染料光转换耦合，然后进行电子显微镜分析是一种强大的技术，允许调查和测量回收囊泡池（Harata et al。，2001; Schikorski and Stevens，2001; Rizzoli和Betz， 2004）。果蝇神经肌肉接头（NMJ）是具有明确定义的突触引物的有利制剂，其能够快速产生具有突变突触蛋白的细胞系和严格评估囊泡回收池（Akbergenova和Bykhovskaia，2009; ...
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| Extracellular Axon Stimulation
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] This is a detailed protocol explaining how to perform extracellular axon stimulations as described in Städele and Stein, 2016. The ability to stimulate and record action potentials is essential to electrophysiological examinations of neuronal function. Extracellular stimulation of axons traveling in fiber bundles (nerves) is a classical technique in brain research and a fundamental tool in neurophysiology (Abbas and Miller, 2004; Barry, 2015; Basser and Roth, 2000; Cogan, 2008). It allows for activating action potentials in individual or multiple axons, controlling their firing frequency, provides information about the speed of neuronal communication, and neuron health and function.
[摘要] 这是一个详细的协议，说明如何执行细胞外轴突刺激，如Städele和Stein，2016所述。刺激和记录动作电位的能力对神经元功能的电生理检查至关重要。 在纤维束（神经）中行进的轴突的细胞外刺激是脑研究中的一种经典技术，也是神经生理学的基础工具（Abbas和Miller，2004; Barry，2015; Basser和Roth，2000; Cogan，2008）。 它允许在单个或多个轴突中激活动作电位，控制其发射频率，提供关于神经元通信速度以及神经元健康和功能的信息。
【背景】细胞外轴突刺激引起动作电位（AP），而不需要将电极引入神经元。该方案描述了阴极刺激，其使用静息神经元的膜电位为负，而细胞外周围为正的事实。需要两个电极：（1）放置在轴突附近的刺激电极（阴极）和（2）置于浴中的参比电极（阳极）。当激活时，刺激电极向轴突的外部添加电子，从而增加负电荷。这使得轴突的外侧不太积极，因此减小神经元内外的潜在差异。结果是轴突内部局部去极化。如果数量足够，这会引起AP。引发的AP起始于靠近刺激电极并沿着轴突双向传播。
引起AP所需的阈值电流取决于几个参数，包括（1）轴突直径（较粗略的轴突首先被去极化），（2）刺激电极和轴突之间的距离，以及（3）刺激幅度和持续时间。持续时间必须限制在少于AP的持续时间以防止神经元膜变得难治性。因此，通常使用阈值幅度的短电流脉冲来引出各个AP。由于在较低的刺激振幅下招募较厚的轴突，所以如果感兴趣的轴突是神经中最大直径的轴突，则细胞外刺激效果最好。如果靶向较小的轴突，则需要较大的刺激振幅，除了感兴趣的较小轴突之外，还可以首先激活较大的轴突。 ...
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| Axonal Conduction Velocity Measurement
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Action potential conduction velocity is the speed at which an action potential (AP) propagates along an axon. Measuring AP conduction velocity is instrumental in determining neuron health, function, and computational capability, as well as in determining short-term dynamics of neuronal communication and AP initiation (Ballo and Bucher, 2009; Bullock, 1951; Meeks and Mennerick, 2007; Rosenthal and Bezanilla, 2000; Städele and Stein, 2016; Swadlow and Waxman, 1976). Conduction velocity can be measured using extracellular recordings along the nerve through which the axon projects. Depending on the number of axons in the nerve, AP velocities of individual or many axons can be detected.
This protocol outlines how to measure AP conduction velocity of (A) stimulated APs and (B) ...
[摘要] 动作电位传导速度是动作电位（AP）沿着轴突传播的速度。测量AP传导速度有助于确定神经元的健康，功能和计算能力，以及确定神经元通信和AP启动的短期动力学（Ballo和Bucher，2009; Bullock，1951; Meeks and Mennerick，2007; Rosenthal和Bezanilla，2000;Städele和Stein，2016; Swadlow和Waxman，1976）。传导速度可以通过沿轴突投射的神经的细胞外记录来测量。根据神经中的轴突数量，可以检测个体或许多轴突的AP速度。
该协议概述了如何通过使用两个空间距离的细胞外电极来测量（A）刺激的AP和（B）自发产生的AP的AP传导速度。虽然这里使用无脊椎动物神经系统，但是这种技术的原理是普遍的，并且可以容易地调整到其他神经系统制剂（包括脊椎动物）。
【背景】神经系统中的长距离通讯是由沿轴突行进的AP介导的。当产生AP时流过轴突膜的离子电流（Hodgkin和Huxley，1952）可以使用细胞外记录电极在神经元外部检测。不同神经元中的AP传导速度是非常可变的，范围从每秒200米（447英里每小时）到小于0.1米每秒（每小时0.2英里）（Kress等人，2008; ...
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