| Real-time Base Excision Repair Assay to Measure the Activity of the 8-oxoguanine DNA Glycosylase 1 in Isolated Mitochondria of Human Skin Fibroblasts
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) is one of the most common and mutagenic oxidative DNA damages induced by reactive oxygen species (ROS). Since ROS is mainly produced in the inner membranes of the mitochondria, these organelles and especially the mitochondrial DNA (mtDNA) contained therein are particularly affected by this damage. Insufficient elimination of 8-oxoG can lead to mutations and thus to severe mitochondrial dysfunctions. To eliminate 8-oxoG, the human body uses the enzyme 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1), which is the main antagonist to oxidative damage to DNA. However, previous work suggests that the activity of the human OGG1 (hOGG1) decreases with age, leading to an age-related accumulation of 8-oxoG. A better understanding of the exact mechanisms of hOGG1 could lead ...
[摘要] [摘要] 7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）是由活性氧（ROS）引起的最常见且诱变的氧化DN A损伤之一。由于ROS主要在线粒体的内膜中产生，因此这些细胞器，特别是其中所含的线粒体DNA（mtDNA）受到这种损害的特别影响。消除8-oxoG可能会导致突变，从而导致严重的线粒体功能障碍。为了消除8-oxoG，人体使用了8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1（OGG1），它是DNA氧化损伤的主要拮抗剂。但是，先前的研究表明，人类OGG1的活性（h OGG1）随着年龄的增长而减少，导致与年龄相关的8-oxoG积累。更好地了解hOGG1的确切机制可能会导致发现新的靶标，因此对于开发预防性疗法具有重要意义。因此，我们开发了一种实时碱基切除修复测定法，该测定法采用了专门设计的双链报告寡核苷酸来测量分离的线粒体裂解物中hOGG1的活性。这里介绍的该系统与经典测定法不同，在经典测定法中，可以通过实时测量hOGG1活性通过变性丙烯酰胺凝胶进行终点测定。另外，为了确定该双功能酶的每个酶促步骤的活性（N-糖基化酶和AP-裂解酶活性），还可以进行解链曲线分析。使用各种离心步骤从人成纤维细胞中分离线粒体后，将其裂解，然后与专门设计的报告寡核苷酸一起孵育。hOGG1活性的后续测量是在常规实时PCR系统中进行的。
[背景]人体是永久的损害案例。每天约10 ...
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| Microarray, IPA and GSEA Analysis in Mice Models
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] This protocol details a method to analyze two tissue samples at the transcriptomic level using microarray analysis, ingenuity pathway analysis (IPA) and gene set enrichment analysis (GSEA). Methods such as these provide insight into the mechanisms underlying biological differences across two samples and thus can be applied to interrogate a variety of processes across different tissue samples, conditions, and the like. The full method detailed below can be applied to determine the effects of muscle-specific Notch1 activation in the mdx mouse model and to analyze previously published microarray data of human liposarcoma cell lines.
[摘要] 该协议详述了使用微阵列分析，独创性途径分析（IPA）和基因集富集分析（GSEA）在转录组水平分析两个组织样品的方法。 诸如此类的方法提供了对两个样品之间的生物学差异的潜在机制的洞察，因此可以应用于跨越不同组织样品，条件等询问各种过程。 下面详述的完整方法可用于确定肌肉特异性Notch1激活在 mdx 小鼠模型中的作用，并分析先前公布的人脂肪肉瘤细胞系的微阵列数据。
【背景】各种细胞类型的转录组学分析对于阐明细胞的功能元件至关重要，可以深入了解细胞特异性特征，并可突出与不同发育或疾病阶段相关的变化（Wang et al。，2009） 。虽然RNA测序变得越来越流行，但分析的相对成本和时间可能是一种负担。因此，微阵列分析是比较各种mRNA样品之间相对基因表达水平的替代工具（Read et al。，2001）。微阵列通常用于研究与疾病状态相关的变化，其疾病状态的基因表达模式可以被推断或已经被定义（Amaratunga et al。，2007）。 Ingenuity途径分析（IPA，QIAGEN）通常与大规模组学数据结合使用，并提供有关不同样本可能显着改变的途径，基因和其他特征的信息。基因集富集分析（GSEA）使用与各种疾病或途径相关的先验的基因集和特征，以便为感兴趣的样品提供生物学应用。
Bi及其同事使用下述方法来理解Notch信号传导在肌肉再生和脂肪肉瘤中的作用，脂肪肉瘤是一种常见的软组织癌类型（Bi ...
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| Chromatin Immunoprecipitation Experiments from Whole Drosophila Embryos or Larval Imaginal Discs
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Chromatin Immunoprecipitation coupled either to qPCR (qChIP) or high-throughput sequencing (ChIP-Seq) has been extensively used in the last decades to identify the DNA binding sites of transcription factors or the localization of various histone marks along the genome. The ChIP experiment generally includes 7 steps: collection of biological samples (A), cross-linking proteins to DNA (B), chromatin isolation and fragmentation by sonication (C), sonication test (D), immunoprecipitation with antibodies against the protein or the histone mark of interest (E), DNA recovery (E), identification of factor-associated DNA sequences by PCR or sequencing (F). The protocol described here can readily be used for ChIP-seq and ChIP-qPCR experiments. The entire procedure, describing experimental setup ...
[摘要] 与qPCR（qChIP）或高通量测序（ChIP-Seq）相结合的染色质免疫沉淀已被广泛用于识别转录因子的DNA结合位点或基因组中各种组蛋白标记的定位。 ChIP实验通常包括7个步骤：收集生物样品（A），交联蛋白质到DNA（B），染色质分离和通过超声处理分离（C），超声处理测试（D），用针对蛋白质的抗体进行免疫沉淀感兴趣的组蛋白标记（E），DNA回收（E），通过PCR或测序鉴定因子相关DNA序列（F）。这里描述的协议可以容易地用于ChIP-seq和ChIP-qPCR实验。描述在完整的果蝇组织中优化分析的实验设置条件的整个过程可以在四天内完成。
背景 尽管永生化的培养细胞广泛用于研究各种细胞类型的染色质景观，但是在生理条件下在体内探测相互作用的有价值的方法对于进行转录的时间或空间比较分析是必要的因子和组蛋白修饰图在不同阶段的果蝇发展或不同组织之间。在这里，我们提供了一个详细的ChIP协议，已被优化，以便在整个果蝇胚胎和幼虫成像光盘上工作，突出关键的实验参数。
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