| Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of the process is demonstrated by the simultaneous deletion of up to four programmed cell death mediators in leukemic cell lines and patient-derived acute lymphoblastic leukemia xenografts, in which ...
[摘要] 基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而，生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞，这仍然是一个相对费力的过程。在这里，我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案，包括指导RNA设计，LentiCRISPR克隆，病毒生产和转导，以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物，其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室，生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能，可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。
从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复（CRISPR）的遗传元件的好奇的初步观察开始（Ishino等人，1987; Mojica等人，2000 ）和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑（Cong等人，2013; Mali等人，2013），CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞（Hsu等人，2014）的细胞系统的成功应用，CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂（DSB）（Park等人，2016）。 ...
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| In vitro Floral Induction of Cuscuta reflexa
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] Floral initiation and development in the angiosperms is the essential step on which the yield of the plant depends. Sometimes external climate or any abiotic stress hinders the floral initiation and ultimately affect the plant yield. Hence, in vitro floral induction and development can help to overcome the external climatic factor. Furthermore, the protocol for in vitro floral induction in the parasitic angiosperm like Cuscuta reflexa has not been reported yet. We have standardized the protocol for floral induction in the parasitic plant Cuscuta reflexa. In this study it is established that MMS (modified Murashige Skoog) media supplemented with 2 mg L-1 NAA (naphthalene acetic acid, plant growth regulator) and 2 mg L-1 2,4-D ...
[摘要] 被子植物的花卉引发和发育是植物产量依赖的关键步骤。有时，外部气候或任何非生物胁迫阻碍花卉开始，最终影响植物产量。因此，体外花卉诱导和发育可以帮助克服外部气候因素。此外，尚未报道如在睾丸反射中的寄生被子植物体外花诱导的方案。我们已经规定了寄生植物茧丝反射中花诱导的方案。在本研究中，确定补充有2mg L NAA（萘乙酸，植物生长调节剂）和2mg L -1的MMS（改良的Murashige Skoog）培养基> 2,4-D（2,4-二氯苯氧基丙酸，植物生长调节剂）在体外拍摄后支持花诱导。此外，我们发现补充有2mg L-sup-2,4-D的MMS培养基从淋巴结外植体直接快速诱导花蕾，而没有任何芽伸长。该协议将有助于研究人员在其他被子植物植物中诱导花along与镰刀菌反射。背景 睾丸反射是寄生在大量被子植物上寄生的被子植物（Kuijt，1969）。在宿主植物中造成严重损害和产量损失的能力使得该物种对科学研究非常重要（Nun and Mayer，1999）。除了少数具有功能性叶绿体（Hibberd等人，1998）之外，大多数Cuscuta 物种是非叶绿体。从较大的胚胎开发幼苗。已经报道了白色介质中的反射（Maheshweri和Baldev，1961）。花卉诱导。反射炎在短时间内以及黑暗条件已经在体外中看到（Baldev，1962）。 ...
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| Pot Level Drought Stress Tolerance Assay in Tobacco through Plant Phenotyping and Antioxidant Assay
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Author:
Date:
2015-10-05
[Abstract] Drought is an important abiotic factor which has a huge detrimental impact on crop productivity. Study of plant responses towards drought stress and investigating the mechanism of drought tolerance is crucial for achieving the target of developing drought-tolerant plants. Phenotyping is a cost effective approach which can be adopted to evaluate the severity of drought stress in a plant. Next to phenotyping parameters, biochemical parameters such as the study of antioxidant enzyme activity play significant roles in assessing the extent of drought stress caused injury in a plant. Among the antioxidant enzymes, ascorbate peroxidase is an enzyme which plays a crucial role in drought tolerance in plants. It has been well established that the activity of this enzyme increases under drought ...
[摘要] 干旱是一个重要的非生物因素，对作物生产力有巨大的不利影响。研究植物对干旱胁迫的反应和研究干旱耐受机制对于实现发展耐旱植物的目标是至关重要的。表型是一种成本有效的方法，可用于评价植物中干旱胁迫的严重性。除了表型参数之外，生物化学参数例如抗氧化酶活性的研究在评估植物中干旱胁迫引起的损伤的程度中起重要作用。在抗氧化酶中，抗坏血酸过氧化物酶是在植物的耐旱性中起关键作用的酶。已经确定该酶的活性在干旱胁迫下增加。在这里，我们提出了一个简单和可重复的协议，以调查烟草植物对干旱胁迫通过测量表型参数和抗氧化酶活性的反应。虽然，这些实验已经进行了烟草植物，这个协议可以采用其他作物品种。
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