| Sendai Virus Propagation Using Chicken Eggs
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Sendai virus is a member of the family Paramyxoviridae, and an enveloped virus with a negative-stranded RNA genome. Sendai virus is not pathogenic to humans, but for mice and can cause pneumonia in mice. Easy and efficient techniques for propagating Sendai virus are required for studying virus replication, virus-induced innate- and adaptive-immunity, Sendai-virus-based virotherapy and IgA nephropathy. Here, we describe a protocol for Sendai virus propagation using chicken eggs. This traditional protocol enables us to generate a large amount of virus enough for animal experiments as well as cell culture experiments in a relatively inexpensive way.
[摘要] 仙台病毒是家族副粘病毒科的成员，以及具有负链RNA基因组的包膜病毒。 仙台病毒对人类无致病性，但对小鼠而言可导致小鼠肺炎。 传播仙台病毒的简便有效的技术是研究病毒复制，病毒诱导的先天免疫和适应性免疫，基于仙台病毒的病毒疗法和IgA肾病所必需的。 在这里，我们描述了使用鸡蛋传播仙台病毒的协议。 这种传统的方案使我们能够以相对便宜的方式产生足够的大量病毒用于动物实验以及细胞培养实验。
【背景】仙台病毒（SeV）是一种小鼠副流感病毒1型，于20世纪50年代在日本仙台发现（Ishida和Homma，1978）。该病毒曾被日本病毒学会命名为日本血凝病毒（HVJ），后来被称为“新生病毒性肺炎（仙台型）”（Kuroya和Ishida，1953）。 SeV这个名字目前最受欢迎，现在被认为是老鼠的病原体，而不是人类（Karron RA，2007）。 Fukumi 等人首次描述了1954年小鼠的SeV感染（Fukumi et al。，1954）。这种感染可能是亚临床的，但SeV也被认为是某些小鼠品系中肺炎的主要原因之一（Fukumi et al。，1954; Parker et al。， 1978年）。 SeV是研究以下各个领域的优秀工具：IgA肾病小鼠模型的病理机制（Yamashita et al。，2007; Chintalacharuvu et al。， ...
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| CRISPR/Cas Gene Editing of a Large DNA Virus: African Swine Fever Virus
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Gene editing of large DNA viruses, such as African swine fever virus (ASFV), has traditionally relied on homologous recombination of a donor plasmid consisting of a reporter cassette with surrounding homologous viral DNA. However, this homologous recombination resulting in the desired modified virus is a rare event. We recently reported the use of CRISPR/Cas9 to edit ASFV. The use of CRISPR/Cas9 to modify the African swine fever virus genome resulted in a fast and relatively easy way to introduce genetic changes. To accomplish this goal we first infect primary swine macrophages with a field isolate, ASFV-G, and transfect with the CRISPR/Cas9 donor plasmid along with a plasmid that will express a specific gRNA that targets our gene to be deleted. By inserting a reporter cassette, we are ...
[摘要] 大型DNA病毒（例如非洲猪瘟病毒（ASFV））的基因编辑传统上依赖于由报道盒组成的供体质粒与周围同源病毒DNA的同源重组。然而，这种导致所需修饰病毒的同源重组是罕见的事件。我们最近报道了使用CRISPR / Cas9编辑ASFV。使用CRISPR / Cas9修饰非洲猪瘟病毒基因组导致了引入遗传变化的快速且相对简单的方法。为了实现这一目标，我们首先用田间分离株ASFV-G感染原代猪巨噬细胞，并用CRISPR / Cas9供体质粒转染质粒，该质粒将表达靶向我们基因的特异性gRNA被删除。通过插入报告盒，我们能够通过有限稀释和噬菌斑纯化从亲本中纯化我们的重组病毒。我们以前曾报道将传统的同源重组方法与CRISPR / Cas9进行比较，结果导致重组增加超过4个对数。
【背景】 非洲猪瘟（ASF）是一种由ASF病毒（ASFV）引起的高度致命的猪传染性病毒性疾病。 ASFV的基因组由大约180-190千碱基对的双链DNA基因组组成。 ASFV引起一系列疾病，从高度致命到亚临床，取决于宿主特征和病毒株（Tulman et al。，2009）。 ASFV没有商业疫苗;实验上，2007年格鲁吉亚爆发的唯一能够抵御目前流行病毒株的疫苗（ASFV-G）是含有一个或多个病毒基因组缺失的减毒活疫苗，例如:( O'Donnell et ...
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| A Quick and Easy Method for Making Competent Escherichia coli Cells for Transformation Using Rubidium Chloride
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] This protocol describes a quick and efficient method to make competent E. coli cells for transformation using rubidium chloride. Commercial competent cells are expensive and this protocol provides a cheaper alternative to them.
[摘要] 这个协议描述了一个快速有效的方法来做出胜任的E。 使用氯化铷转化大肠杆菌细胞。 商业感受态细胞是昂贵的，这个协议提供了一个更便宜的选择。
【背景】基因克隆的成功高度依赖于细菌细胞的转化效率。 通过用化学物质或电脉冲处理细胞可以人为地提高效率。 有几个协议可用于准备主管的E。 然而，它们通常是长期的，费力的，并且在能力上表现出不一致。 Green和Rogers（2013）的方案克服了这些缺点，并允许制备高感受态细胞（〜10 6 -10 8 CFU /μgDNA）。 虽然其他协议要求细胞在低温（19-22°C）下生长，但该协议涉及在37°C下生长细胞。 因此，与18-24小时相比，细胞生长更快并且在4小时内达到对数期。 该协议是高度可重复的。
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