| Freeze-fracture-etching Electron Microscopy for Facile Analysis of Yeast Ultrastructure
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] We describe a streamlined method that enables the quick observation of yeast ultrastructure by electron microscopy (EM). Yeast cells are high-pressure frozen, freeze-fractured to cut across the cytoplasm, and freeze-etched to sublimate ice in the cytosol and the organelle lumen. The cellular structures delineated by these procedures are coated by a thin layer of platinum and carbon deposited by vacuum evaporation, and this platinum–carbon layer, or replica, is observed by transmission EM. The method differs from the deep-etching of pre-extracted samples in that intact live cells are processed without any chemical treatment. Lipid droplets made of unetchable lipid esters are observed most prominently, but other organelles–the nucleus, endoplasmic reticulum, Golgi, vacuoles, ...
[摘要] 我们描述了一种流线型的方法，可以通过电子显微镜（EM）快速观察酵母超微结构。 酵母细胞是高压冷冻的，冷冻破碎以跨细胞质切割，并冷冻蚀刻以升华胞质溶胶和细胞器腔内的冰。 通过这些方法描绘的细胞结构涂覆有通过真空蒸发沉积的铂和碳薄层，并且通过传输EM观察该铂 - 碳层或复制品。 该方法不同于预提取样品的深刻蚀，因为完整的活细胞在没有任何化学处理的情况下进行处理。 最突出的是观察到由不可获得的脂质酯制成的脂滴，但是可以容易地分析其他细胞器 - 细胞核，内质网，高尔基体，空泡，线粒体及其相互关系。 值得注意的是，从快速冷冻到EM观察的整个过程都可以在一天之内完成。
【背景】萌发酵母（Saccharomyces cerevisiae）可能是最常用的模型生物，应用各种各样的实验技术和复杂的全基因组数据库的存在大大促进了研究进展（Botstein和Fink，2011）。然而，由于其相对较小的尺寸和圆形，酵母的显微成像并不总是以令人满意的方式进行。细胞壁的存在对于常规电子显微镜（EM）尤其是一个问题，因为它妨碍样品制备中使用的试剂的渗透。快速冷冻酵母的冷冻替代EM目前被认为是超微结构观察的最佳方法（Giddings et al。，2001），但该方法存在缺点，即膜结构不清晰可见，有些细胞成分可能不被保留在有机溶剂中的取代过程中，该程序至少需要几天才能进行观察。
最近在固定相酵母中检查脂肪的研究中，我们使用冷冻断裂蚀刻来分析酵母超微结构（Tsuji ...
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| A Bioimaging Pipeline to Show Membrane Trafficking Regulators Localized to the Golgi Apparatus and Other Organelles in Plant Cells
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Author:
Date:
2015-09-05
[Abstract] The plant Golgi apparatus is composed of numerous stacks of cisterna, designated as cis, medial, and trans Golgi cisternae; these stacks move within the cytoplasm along the actin cytoskeleton. Cis cisternae receive secretory products from endoplasmic reticulum (ER) and they subsequently progress through the stack to the trans cisternae, where they are sorted to other destinations, including cell wall, plasma membrane (PM), vacuoles, and chloroplasts. In addition, the plant Golgi apparatus plays a role of glycosylating proteins as well as synthesizing cell wall polysaccharides, such as hemicelluloses and pectins. This protocol describes procedures for imaging fluorescently-tagged proteins localized to the plant Golgi apparatus of Arabidopsis ...
[摘要] 植物高尔基体包括许多叠状体，称为顺，内侧和反式高尔基这些堆栈在细胞质内沿着肌动蛋白细胞骨架移动。 Ctern 池从内质网（ER）接收分泌产物，并且随后通过堆叠进入反转池，在那里它们被分选到其他目的地，包括细胞壁，血浆膜（PM），液泡和叶绿体。此外，植物高尔基体起到糖基化蛋白质以及合成细胞壁多糖如半纤维素和果胶的作用。该协议描述了使用共聚焦激光显微镜（CLSM），全内反射荧光显微镜（TIRF）和高压的免疫金标记标记定位于拟南芥幼苗的植物高尔基体的荧光标记的蛋白质的程序冷冻/冷冻取代的样品通过透射电子显微镜（TEM）。我们特别关注长期时间推移成像和蛋白质本地化在高尔基内的子域。该方案还可以用于其他细胞器，组织和植物物种。
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