| Preparation of Cell-free Synthesized Proteins Selectively Double Labeled for Single-molecule FRET Studies
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Single-molecule FRET (smFRET) is a powerful tool to investigate molecular structures and conformational changes of biological molecules. The technique requires protein samples that are site-specifically equipped with a pair of donor and acceptor fluorophores. Here, we present a detailed protocol for preparing double-labeled proteins for smFRET studies. The protocol describes two cell-free approaches to achieve a selective label scheme that allows the highest possible accuracy in inter‐dye distance determination.
[摘要] 单分子FRET（smFRET）是研究生物分子的分子结构和构象变化的有力工具。 该技术需要蛋白质样品，该样品是特定位点配有一对供体和受体荧光团的。 在这里，我们提供了一个制备smFRET研究的双标记蛋白的详细方案。 该协议描述了两种无细胞方法来实现选择性标记方案，其允许在染料间距离确定中具有最高可能的准确性。
【背景】单分子FRET（smFRET）是结构生物学中最重要的工具之一，特别是用于分析蛋白质的结构和功能构象变化（Michalet等人，2006; Roy等人。，2008; Sustarsic和Kapanidis，2015）。然而，smFRET的广泛应用在许多情况下受限于合适的蛋白质样品的精细生产。这些蛋白质需要配备两个荧光团，位点特异性连接在蛋白质结构内的不同位置。
经典的基于细胞的蛋白质生产需要一系列耗时的步骤，可以通过使用无细胞蛋白质合成（CFPS）系统来克服，允许更快且直接地生产和选择适当的双标记蛋白质。此外，CFPS的另一个优点是由于几类蛋白质如蛋白酶或膜蛋白对活细胞或其他原因有毒，难以在细胞中表达，可以在CFPS系统中成功合成。最后，CFPS是专注于光谱技术如smFRET的实验室的理想工具，因为细胞培养不是必需的，并且不必考虑重组生物的安全规定。
尽管smFRET所需的样本量本质上很低，但迄今为止，在smFRET研究中，CFPS尚未被标准地用于生产样本。这主要是由于与基于细胞的系统相比蛋白质产量低得多，并且缺乏适当的无细胞方法，其允许适当量的双标记蛋白质的方便合成。然而，正如我们的小组所表明的那样，得益于更高效的正交标记方案（Sadoine ...
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| Post-crystallization Improvement of RNA Crystals by Synergistic Ion Exchange and Dehydration
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Author:
Date:
2015-09-05
[Abstract] Compared to the recent dramatic growth in the numbers of genome-wide and functional studies of complex non-coding RNAs, mechanistic and structural analyses have lagged behind. A major technical bottleneck in the structural determination of large RNAs and their complexes is preparation of diffracting crystals. Empirically, a vast majority of such RNA crystals fail to diffract X-rays to usable resolution (~4 Å) due to their inherent disorder and non-specific packing within the crystals. Here, we present a protocol that combines post-crystallization cation replacement and dehydration that dramatically improved the diffraction quality of crystals of a large gene-regulatory mRNA-tRNA complex. This procedure not only extended the resolution limit of X-ray data from 8.5 to 3.2 Å, but also ...
[摘要] 与最近在复杂的非编码RNA的基因组范围和功能研究的数量的显着增长相比，机械和结构分析已经落后。在大RNA及其复合物的结构确定中的主要技术瓶颈是衍射晶体的制备。经验上，由于其固有的无序和在晶体内的非特异性堆积，绝大多数这样的RNA晶体不能将X射线衍射到可用的分辨率（〜4）。在这里，我们提出一个协议，结合后结晶阳离子替代和脱水，大大改善晶体的大基因调节mRNA-tRNA复杂的衍射质量。该程序不仅将X射线数据的分辨率极限从8.5扩展到3.2，而且还显着提高了数据的质量，实现了重新定相和结构确定。因为它利用了反离子和溶剂化在RNA结构中的一般重要性，这个程序可能证明在其他大型非编码RNA的晶体学分析中广泛有用。
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