| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use of sensitized emission. Any widefield microscope capable of sensitive single molecule detection of Cy3 and Cy5 should be able to measure FRET in yeast cells. Alternatively, a FRET-FISH method can be ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
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| Single-probe RNA FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Quantitative profiling of mRNA expression is an important part of understanding the state of a cell. The technique of RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) involves targeting an RNA transcript with a set of 40 complementary fluorescently labeled DNA oligonucleotide probes. However, there are many circumstances such as transcripts shorter than 200 nt, splicing variations, or alternate initiation sites that create transcripts that would be indistinguishable to a set of multiple probes. To this end we adapted the standard FISH protocol to allow the use of a single probe with a single fluorophore to quantify the amount of transcripts inside budding yeast cells. In addition to allowing the quantification of short transcripts or short features of transcripts, this technique ...
[摘要] mRNA表达的定量分析是理解细胞状态的重要部分。 RNA荧光原位杂交（FISH）技术涉及用一组40个互补的荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向RNA转录物。 然而，许多情况下，如转录本短于200 nt，剪接变异，或创建转录本的替代起始位点，这些转录本与一组多重探针无法区分。 为此，我们调整了标准FISH方案，以允许使用具有单个荧光团的单个探针来量化出芽酵母细胞内的转录物的量。 除了允许定量短转录本或转录本的短特征之外，该技术还降低了执行FISH的成本。
【背景】通过单分子荧光原位杂交（smFISH）可以精确定量单细胞转录谱。 该过程通过用多个荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向单个mRNA分子给出了良好的噪声信号（Raj和Tyagi，2010）。 使用该方案，不能检测到长度短于200个核苷酸的mRNA。 然而，在大多数实验中，绝对转录本拷贝数比相对拷贝数少。 为了检测短的转录物或序列，可以使用短的单个DNA寡核苷酸探针。 当使用单个荧光团计数mRNA时，单个探针的检测效率大于50％（Wadsworth等人，2017）。
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| Method for Multiplexing CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae Using Artificial Target DNA Sequences
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Genome manipulation has become more accessible given the advent of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) editing technology. The Cas9 endonuclease binds a single stranded (single guide) RNA (sgRNA) fragment that recruits the complex to a corresponding genomic target sequence where it induces a double stranded break. Eukaryotic repair systems allow for the introduction of exogenous DNA, repair of existing mutations, or deletion of endogenous gene products. Targeting of Cas9 to multiple genomic positions (termed ‘multiplexing’) is achieved by the expression of multiple sgRNAs within the same nucleus. However, an ongoing concern of the CRISPR field has been the accidental targeting of Cas9 to alternative (‘off-target’) DNA locations within a genome. We ...
[摘要] 鉴于CRISPR（集群定期间隔短回归重复）编辑技术的出现，基因组操纵变得更加易于使用。 Cas9核酸内切酶将募集复合物的单链（单向导）RNA（sgRNA）片段结合到相应的基因组靶序列，引发双链断裂。真核修复系统允许引入外源DNA，修复现有突变或内源基因产物的缺失。通过在同一核内表达多个sgRNA来实现Cas9对多个基因组位置的定位（称为“多重”）。然而，CRISPR领域的持续关注是将Cas9意外地定位到基因组内的替代（“脱靶”）DNA位置。我们将安装的人造Cas9靶序列的使用（称为人造基因座上的Cas9复制）描述为允许（i）与单个sgRNA复用的酵母基因组中的用途; （ii）减少/消除可能的脱靶效应，以及（iii）精确控制预定目标序列的放置。
【背景】CRISPR（集群定期间隔回归重复）机制已经在原核生物中演变为具有很高精度编辑任何基因组的能力的原始适应性免疫系统（Jinek等，2012; Sorek等，2013）。这种生物技术需要使用来自化脓性链球菌（或othologous物种）的内切核酸酶（Cas9），单个RNA'引导'序列和外源供体DNA（如果需要）。仅在短短几年内，CRISPR / ...
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