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Author:
Date:
2015-07-05
[Abstract] The protocols presented here allow for the facile generation of a wide variety of complex multipart DNA constructs (tagged gene products, gene fusions, chimeric proteins, and other variants) using homologous recombination and in vivo ligation in budding yeast (Saccharomyces cerevisiae). This method is straightforward, efficient and cost-effective, and can be used both for vector creation and for subsequent one-step, high frequency integration into a chromosomal locus in yeast. The procedure utilizes PCR with extended oligonucleotide “tails” of homology between multiple fragments to allow for reassembly in yeast in a single transformation followed by a method for highly efficient plasmid extraction from yeast (for transformation into bacteria). The latter is an ...
[摘要] 这里提出的方案允许使用发芽酵母（酿酒酵母）中的同源重组和体内连接，容易地生成各种复杂的多部分DNA构建体（标记的基因产物，基因融合体，嵌合蛋白和其他变体）。该方法是直接，有效和成本有效的，并且可以用于载体创建和用于后续的一步，高频整合到酵母中的染色体位点。该方法利用PCR扩增多个片段之间的同源性的寡核苷酸“尾”，以允许在单次转化中重组酵母，随后用酵母高效质粒提取（用于转化为细菌）的方法。后者是对现有的酵母质粒提取方法的改进，其历史上已经是恢复所需构建体的限制步骤。我们描述了我们的技术的实用性和便利性，并提供了几个例子。
【背景】酿酒酵母中的同源重组（HR）早已被公认为在体内组装DNA片段的非常方便的方法（Szostak等，1983; Ma等，1987; Oldenburg等，1997）。鉴于酵母中人力资源的效率，它已经被利用了增加其效用，增强其多功能性并允许其应用于广泛的实验目标的方式。这种一般方法的改进包括使用体内连接作为定向诱变的平台（Muhlrad等人，1992），引入反选择以帮助质粒产生（Gunyuzlu等人，2001; Anderson和Haj-Ahmad，2003）和使体内组装适应于不能在酵母中繁殖的载体（Iizasa和Nagano，2006; ...
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