| Quantitative Kinetic Analyses of Histone Turnover Using Imaging and Flow Cytometry
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Dynamic histone changes occur as a central part of chromatin regulation. Deposition of histone variants and post-translational modifications of histones are strongly associated with properties of chromatin status. Characterizing the kinetics of histone variants allows important insights into transcription regulation, chromatin maintenance and other chromatin properties. Here we provide a protocol of quantitative and sensitive approaches to test the timing of incorporation and dissociation of histones using a two-color SNAP-labeling system, labelling pre-existing and newly-incorporated histones distinctly. Together with cell cycle synchronization methods and cell cycle markers, this approach enables a pulse-chase analysis to determine the turnover of histone variants during the cell cycle, ...
[摘要] [摘要] 动态的组蛋白变化是染色质调节的核心部分。组蛋白变体的沉积和组蛋白的翻译后修饰与染色质状态的属性密切相关。表征组蛋白变体的动力学特性可为深入了解转录调控，染色质维持和其他染色质特性提供重要信息。在这里，我们提供了一种定量和敏感方法的协议，以使用双色SNAP标记系统测试组蛋白的结合和解离时间，分别标记预先存在的和新结合的组蛋白。结合细胞周期同步方法和细胞周期标志物，这种方法可以进行脉冲追踪分析，以确定在细胞周期内使用成像或流式细胞仪方法以单细胞分辨率检测到的组蛋白变体的周转率。除了测试整体组蛋白更新，还可以使用成像方法解决组蛋白变体的细胞周期依赖性细胞定位。
[背景] 染色质重塑是真核细胞众多基本细胞活动的一部分（Geiman 和Robertson，2002；Clapier 和Cairns ，2009）。转录因子和RNA聚合酶的可及性通常与DNA甲基化和染色质状态的变化相关，包括可及性，翻译后的组蛋白修饰和组蛋白变体的沉积。组蛋白变体差异性地调节调节发育，细胞分化或其他生理活动的基因表达（Banaszynski 等，2010）。它们在DNA修复，端粒维护，异染色质形成和染色质分离中也发挥着不同的作用（Henikoff 和Smith，2015； Zink和Hake，2016）。此外，组蛋白变体的掺入失调与癌症有关（Vardabasso et ...
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| An Acute Mouse Spinal Cord Slice Preparation for Studying Glial Activation ex vivo
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] Pathological conditions such as amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury and chronic pain are characterized by activation of astrocytes and microglia in spinal cord and have been modeled in rodents. In vivo imaging at cellular level in these animal models is limited due to the spinal cord’s highly myelinated funiculi. The preparation of acute slices may offer an alternative and valuable strategy to collect structural and functional information in vitro from dorsal, lateral and ventral regions of spinal cord. Here, we describe a procedure for preparing acute slices from mouse spinal cord (Garré et al., 2016). This preparation should allow further understanding of how glial cells in spinal cord respond acutely to various inflammatory challenges.
[摘要] 病理状况如肌萎缩性侧索硬化，脊髓损伤和慢性疼痛的特征在于脊髓中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，并已在啮齿动物中建模。 在这些动物模型中的细胞水平的体内成像由于脊髓的高度髓鞘化的功能而受到限制。 急性切片的制备可能提供一种替代和有价值的策略，从脊髓的背侧，外侧和腹侧区域体外收集结构和功能信息。 在这里，我们描述了一种从小鼠脊髓制备急性切片的过程（Garréet al。，2016）。 这个准备应该进一步了解脊髓中的神经胶质细胞是如何急剧地反应各种炎症的挑战。
【背景】已经使用小鼠转基因技术来模拟影响脊髓的不同人类病态，其中许多特征为局部胶质激活，神经炎症的一个标志。利用基于激光扫描显微技术的共焦显微镜（White et al。，1987）和双光子显微镜（Denk等，1990），大大提高了对健康和疾病中胶质生物学的认识。 ）以无创的方式可视化活体动物中的细胞结构和亚细胞结构域;例如，表达遗传编码的记者或钙传感器的小鼠已被用于分别形成胶质结构（体细胞和过程）并研究钙动力学和信号传导（Davalos等人，2005; ...
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| RNA Chromatin Immunoprecipitation (RNA-ChIP) in Caenorhabditis elegans
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Author:
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2014-12-20
[Abstract] The RNA chromatin immunoprecipitation assay (RNA-ChIP) allows detection and quantification of RNA–protein interactions using in vivo cross-linking with formaldehyde followed by immunoprecipitation of the RNA–protein complexes. Here we describe the RNA–ChIP protocol that we have adapted for Caenorhabditis elegans (C. elegans) to detect interaction between the nuclear Argonaute CSR-1 (chromosome segregation and RNAi deficient) protein and its target nascent RNAs. We have used a transgenic strain expressing a recombinant long isoform of CSR-1 protein fused with N-terminal 3x FLAG epitope.
[摘要] RNA染色质免疫沉淀测定（RNA-ChIP）允许使用体内与甲醛交联，随后RNA-蛋白复合物的免疫沉淀来检测和定量RNA-蛋白质相互作用。 在这里我们描述我们已经适应于秀丽隐杆线虫（ C. elegans ）的RNA-ChIP协议以检测核Argonaute CSR-1（染色体分离和RNAi缺陷 ）蛋白及其目标新生RNA。 我们使用表达与N-末端3x FLAG表位融合的CSR-1蛋白的重组长同种型的转基因菌株。
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