| Pollen Germination and Pollen Tube Growth of Arabidopsis thaliana: In vitro and Semi in vivo Methods
|
|
Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Studies of pollen germination and post-germination development are not only essential for understanding plant reproduction but also are an excellent model system for tip-based growth. Here we describe easy, reproducible methods for germination and growth of pollen from the model plant Arabidopsis thaliana in artificial conditions. Our growth system can be used both for pollen placed directly on this artificial substrate as well as for the so-called ‘semi in vivo’ method. This is where a pistil is cut shortly after hand-pollination and the pollen tubes grow through the plant tissue and emerge from the cut end onto the surface of the artificial medium.
[摘要] 花粉萌发和萌发后发育的研究不仅对于理解植物繁殖是必不可少的，而且也是用于尖端生长的优秀模型系统。 在这里，我们描述了简单，可重复的方法，用于在人工条件下从模式植物拟南芥中萌发和生长花粉。 我们的生长系统既可用于直接置于该人工基质上的花粉，也可用于所谓的“半体内”方法。 这是在手动授粉后不久切割雌蕊并且花粉管通过植物组织生长并从切割末端出现在人工培养基表面上的地方。
【背景】 开花植物的花粉被广泛用作快速，尖端生长的模型系统。当然，花粉生物学的研究对于了解植物的生育力和生殖发育也是必不可少的。然而，一种简单可靠的方法是从模式植物拟南芥中萌发花粉并在体外维持快速，形态正常的花粉管生长令人沮丧地难以捉摸。在开发我们自己的方法（Rodriguez-Enriquez et al。，2013）之前，我们尝试复制几种已发表的方法，但经过多次尝试后，我们未能产生令人满意的结果。例如，在实验室中复制Boavida和McCormick的方法很困难，因为它具有非常窄的温度最佳值（22°C），这种情况显然不能反映 A的生殖生物学。拟南芥（Boavida和McCormick，2007）。此外，在该方法中存在发芽率和局部花粉密度的问题，其也不完全反映在柱头表面上的自然事件。我们的第一个线索是，体外可靠的花粉萌发所需的关键“缺失因子”来自观察到放置 ...
|
|
|
| ChIP-seq Experiment and Data Analysis in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
|
|
Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Nitrogen is an essential nutrient for all living organisms. In cyanobacteria, a group of oxygenic photosynthetic bacteria, nitrogen homeostasis is maintained by an intricate regulatory network around the transcription factor NtcA. Although mechanisms controlling NtcA activity appear to be well understood, the sets of genes under its control (i.e., its regulon) remain poorly defined. In this protocol, we describe the procedure for chromatin immunoprecipitation using NtcA antibodies, followed by DNA sequencing analysis (ChIP-seq) during early acclimation to nitrogen starvation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). This protocol can be extended to analyze any DNA-binding protein in cyanobacteria for which suitable antibodies ...
[摘要] 氮是所有生物体的必需营养素。 在蓝细菌中，一组含氧光合细菌通过围绕转录因子NtcA的错综复杂的调节网络维持氮稳态。 尽管控制NtcA活性的机制似乎已被很好地理解，但其控制下的基因集（即它的调节子）仍然没有很好的定义。 在该协议中，我们描述了使用NtcA抗体进行染色质免疫沉淀的过程，随后在蓝藻Synechocystis sp。早期适应氮饥饿期间进行DNA测序分析（ChIP-seq）。 PCC 6803（以下简称<集气囊）。 该协议可以扩展到分析蓝细菌中存在合适抗体的任何DNA结合蛋白。
【背景】为了维持体内平衡，细菌经常需要响应环境变化来调整基因表达。许多这些调整是由转录因子（TF）控制的，这些转录因子可以感知代谢信号并激活或抑制目标基因。然而，反映传统上费力的任务来表征TFs在体内的活性和范围，我们对它们在细菌中的结合位点的了解仍然有限。直到最近，染色质免疫沉淀与高通量测序分析的结合为快速确定基因组水平调节子打开了大门。特别是，ChIP-seq使用下一代测序（NGS）的能力来并行识别大量DNA序列。与微阵列相比，ChIP-seq的一个有吸引力的特征是对某些区域如启动子序列没有限制，并且可以研究整个基因组的TF结合位点。
在蓝细菌中，氮同化和代谢的全球调节剂是NtcA，属于CRP（cAMP受体蛋白）家族的TF（Herrero等人，2001）。在集胞蓝细菌中，NtcA通过将二聚体结合至包含共有序列GTAN ...
|
|
|
| CRISPR/Cas9 Editing of the Bacillus subtilis Genome
|
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] A fundamental procedure for most modern biologists is the genetic manipulation of the organism under study. Although many different methods for editing bacterial genomes have been used in laboratories for decades, the adaptation of CRISPR/Cas9 technology to bacterial genetics has allowed researchers to manipulate bacterial genomes with unparalleled facility. CRISPR/Cas9 has allowed for genome edits to be more precise, while also increasing the efficiency of transferring mutations into a variety of genetic backgrounds. As a result, the advantages are realized in tractable organisms and organisms that have been refractory to genetic manipulation. Here, we describe our method for editing the genome of the bacterium Bacillus subtilis. Our method is highly efficient, resulting in ...
[摘要] 大多数现代生物学家的基本过程是研究生物体的遗传操作。尽管许多不同的方法用于编辑细菌基因组已经在实验室中使用了数十年，但CRISPR / Cas9技术对细菌遗传学的适应使得研究人员能够以无与伦比的设施来操纵细菌基因组。 CRISPR / Cas9允许基因组编辑更精确，同时也提高将突变转移到各种遗传背景的效率。因此，在遗传操作难以处理的易处理生物和生物体中实现了这些优点。在这里，我们描述了我们编辑枯草芽孢杆菌细菌基因组的方法。我们的方法是高效的，导致精确，无标记的突变。此外，在产生编辑质粒之后，可以将突变快速导入几个遗传背景，大大增加可进行遗传分析的速度。
枯草芽孢杆菌是高度易处理的革兰氏阳性菌。遗传研究适用于使用多种载体通过同源重组快速有效地引入突变。尽管有许多不同的方法来引入B突变。 subtilis，每种方法都有其局限性。一种简单而简单的方法，用于在B中进行突变。枯草芽孢杆菌是基因破坏，其中将质粒整合到感兴趣的基因内（Vagner等人，1998）。主要的局限性包括：1）扰乱操纵子的极地作用的潜力; 2）引进和保留外来DNA; 3）一旦使用抗生素耐药性盒，如果在其他突变的背景下研究给定的突变，则研究者必须使用不同的盒;和4）该方法限于靶向整个基因，并且不能产生更精确的点突变。 ...
|
|
|