| Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry of Oxygen Sensitive Proteins
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The protocol detailed here describes a way to perform hydrogen deuterium exchange coupled to mass spectrometry (HDX-MS) on oxygen sensitive proteins. HDX-MS is a powerful tool for studying the protein structure-function relationship. Applying this technique to anaerobic proteins provides insight into the mechanism of proteins that perform oxygen sensitive chemistry. A problem when using HDX-MS to study anaerobic proteins is that there are many parts that require constant movement into and out of an anaerobic chamber. This can affect the seal, increasing the likelihood of oxygen exposure. Exposure to oxygen causes the cofactors bound to these proteins, a common example being FeS clusters, to no longer interact with the amino acid residues responsible for coordinating the FeS clusters, ...
[摘要] 本文详述的方案描述了一种在氧敏感蛋白质上进行氢氘交换偶联质谱（HDX-MS）的方法。 HDX-MS是研究蛋白质结构 - 功能关系的强大工具。将这种技术应用于厌氧蛋白质可以深入了解执行氧敏化学的蛋白质的机制。使用HDX-MS研究厌氧蛋白时的一个问题是，有许多部分需要不断运动进出厌氧室。这会影响密封，增加氧气暴露的可能性。暴露于氧气使得与这些蛋白质结合的辅因子（一个常见的例子是FeS簇）不再与负责配位FeS簇的氨基酸残基相互作用，造成簇的丢失和蛋白质的不可逆失活。为了解决这个问题，开发了一种双瓶系统，可以厌氧地制备溶液和反应混合物，但也可以将这些溶液转移到有氧环境中，同时屏蔽溶液中的氧气。此外，运动不受限制，就像厌氧室一样，确保更一致的数据，并在反应过程中减少错误。
【背景】许多氧敏感蛋白质是生物在缺氧环境中繁殖所必需的。这些蛋白质中的一些通过被称为基于黄素的电子分叉（FBEB）（Lubner等，2017）的方法向厌氧微生物提供替代的能量供应。 FBEB产生还原型铁氧还蛋白，可被氧化产生能量。能够降低铁氧还蛋白的蛋白质引起了极大的兴趣，并且一直是最近使用HDX-MS研究的重点（Demmer et al。，2016; Lubner 等人）， 2017; Berry等人，2018）。 ...
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| Fluorometric Estimation of Viral Thermal Stability
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Author:
Date:
2014-08-05
[Abstract] Differential Scanning Fluorimetry (DSF) is a rapid, economical, and a straightforward technique for estimating the thermal stability of proteins. The principle involves the binding of a fluorescent dye to thermally exposed hydrophobic pockets of a protein. The dyes used in this technique are highly fluorescent in a non-polar environment and are quenched when exposed to aqueous solution. The change in fluorescence can be used to follow unfolding of proteins induced by temperature, pH, or chaotropic agents. The method is well characterized for monomeric proteins. Here, we extend the application to supramolecular protein and nucleo-protein complexes using virus particles as an example. SYPRO-orange™ dye is the dye of choice because it is matched for use with q-PCR instruments and the ...
[摘要] 差示扫描荧光测定（DSF）是一种快速，经济，直接的技术，用于估计蛋白质的热稳定性。该原理涉及荧光染料与蛋白质的热暴露的疏水口袋的结合。在该技术中使用的染料在非极性环境中是高度荧光的，并且当暴露于水溶液时淬灭。荧光的变化可用于跟踪由温度，pH或离液剂诱导的蛋白质的解折叠。该方法充分表征了单体蛋白质。在这里，我们将应用程序扩展到超分子蛋白和核蛋白复合物使用病毒颗粒为例。 SYPRO-orange™染料是首选的染料，因为它与q-PCR仪器配合使用，荧光响应在宽的pH和温度范围内是稳定的。该技术相对于标准生物物理方法的优点包括对生物和技术重复的高通量筛选的能力和高灵敏度。
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