| Biomechanical Characterization of Onion Epidermal Cell Walls
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] Here we describe two experimental protocols to measure the biomechanical properties of primary (growing) plant cell walls, with a focus on analyzing cell wall epidermal strips of onion scales. The first protocol measures cell wall creep (time-dependent irreversible extension) under constant force. Such creep is often mediated by the wall-loosening action of expansin or selective endoglucanases. The second protocol is based on two consecutive stretches of the wall and measures the wall’s elastic and plastic compliances, which depend on cell wall structure. These two assays provide complementary information that may be linked to cell wall structure and expansive growth of cells.
[摘要] 在这里，我们描述了两个实验协议来衡量的主要（成长）植物细胞壁的生物力学性能，重点是分析洋葱鳞片的细胞壁表皮带。 第一个协议测量细胞壁蠕变（时间依赖的不可逆扩展）在恒定的力量下。 这种蠕变通常由膨胀素或选择性内切葡聚糖酶的壁松弛作用介导。 第二种方案是基于两个连续的壁延伸并测量壁的弹性和塑性顺从性，这取决于细胞壁结构。 这两个测定提供了可能与细胞壁结构和细胞膨胀生长相关的补充信息。
【背景】生长的植物细胞的主壁足够强以抵抗由细胞膨压产生的张力，但由于扩展蛋白或其它不可逆细胞壁增大所必需的催化剂的选择性松动作用，细胞生长期间可能不可逆地膨胀（Cosgrove， 2016a和2016b）。细胞壁力学性质（如弹性和可塑性）的评估对于理解细胞壁结构及其在生长（细胞增大）和生长停止后的改变是重要的。墙体力学的一个重要测量方法是基于单轴拉伸试验，如我们在测量弹性和塑性柔量（柔量是模量的倒数;模量是刚度的度量）的应力/应变试验中所述。另一种互补测定法是基于不可逆的，随时间增长的长度（蠕变），其在原始细胞壁中发生，当它们保持恒定的张力并且被内源性膨胀素或外源内切葡聚糖酶持续松弛时（Durachko和Cosgrove，2009; Cosgrove ，2011; ...
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| Streptavidin Bead Pulldown Assay to Determine Protein Homooligomerization
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Pulldown assay is a conventional method to determine protein-protein interactions in vitro. Expressing a protein of interest with two different tags allows testing whether both versions can be captured via one of the two tags as homooligomeric complex. This protocol is based on streptavidin bead capture of a biotinylated protein and co-associated Flag-tagged protein using Streptavidin MagBeads.
[摘要] Pulldown分析是一种常规的方法来确定蛋白质在体外的相互作用。 用两种不同的标签表达感兴趣的蛋白质可以检测两种标签是否可以通过两种标签之一作为同低聚体复合物来捕获。 该方案基于使用链霉抗生物素蛋白MagBeads的链霉抗生物素蛋白珠捕获生物素化蛋白质和共结合Flag标记蛋白质。
【背景】淀粉样前体蛋白（APP）可以通过其大的胞外结构域及其跨膜结构域形成同型二聚体，在生物学功能中起重要作用。 目前的方案已被用于表征APP跨膜C-末端99个氨基酸片段（C99）的同二聚化（Yan等人，2017）。 该检测的基本原理如图1所示：链霉亲和素包被的MagBeads可以捕获生物素化的蛋白质，这可以拉下相互作用蛋白质，并通过抗FLAG抗体检测。
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图1.基于MagBeads的pull-down测定的原理在该特定的方案中，使用生物素化的Avi-标记的C99蛋白和相关的C99-TEV位点-rTA-Flag蛋白质。
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| Isolation and Quantification of Plant Extracellular Vesicles
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication by transporting proteins and RNA. While plant cells secrete EVs, they have only recently been isolated and questions regarding their biogenesis, release, uptake and function remain unanswered. Here, we present a detailed protocol for isolating EVs from the apoplastic wash of Arabidopsis thaliana leaves. The isolated EVs can be quantified using a fluorometric dye to assess total membrane content.
[摘要] 细胞外囊泡（EVs）通过传递蛋白质和RNA在细胞间通讯中发挥重要作用。 虽然植物细胞分泌电动汽车，但是它们最近才被孤立，并且关于它们的生物发生，释放，摄取和功能的问题仍然没有得到回答。 在这里，我们提出了一个详细的方案，用于从拟南芥叶片的脱水洗涤中分离EV。 可以使用荧光染料定量分离的EV，以评估总膜含量。
【背景】细胞外囊泡（EVs）是介导蛋白质，脂质和遗传物质的细胞与细胞转移的膜结合结构。由于哺乳动物EVs转运RNA和调节免疫反应的能力，对哺乳动物EV的兴趣已经增长。哺乳动物EV通常被分离用于从培养细胞的培养基中研究，以及生物流体的增长列表（Colombo等，2014）。植物电动车也被认为在免疫反应中起作用，但比较缺乏（An et al。，2007; Davis et al。，2016）。这在很大程度上归因于没有孤立的方法。
虽然植物EVs自1967年以来一直被观察到，使用透射电子显微镜，但直到2009年才开发出分离方法（Halperin和Jensen，1967）。 ...
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