| Proximal Ligation Assay (PLA) on Lung Tissue and Cultured Macrophages to Demonstrate Protein-protein Interaction
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] In this protocol, we describe proximal ligation assay (PLA), an antibody-based detection method for protein-protein interaction. This method relies on specific binding of individual primary antibodies to the two putative interacting proteins. The primary antibodies need to have different hosts. The secondary antibodies against the two hosts have complementary oligonucleotide moieties attached to them. If the two antigens are in close proximity (presumably interacting with each other), the complementary oligonucleotides can anneal and fluorescent nucleotides can be incorporated in a single DNA polymerization step. Under a microscope, these reactions appear as punctate fluorescent spots, indicating successful PLA reaction and suggesting protein-protein interaction between the two antigens.
[摘要] 在这个协议中，我们描述近端连接测定（PLA），一种基于抗体的蛋白质相互作用检测方法。 这种方法依赖于个别一抗与两个推定的相互作用蛋白的特异性结合。 一抗需要有不同的宿主。 针对两种宿主的二抗具有与其连接的互补的寡核苷酸部分。 如果两种抗原紧密接近（推测彼此相互作用），则互补的寡核苷酸可以退火，并且荧光核苷酸可以并入单个DNA聚合步骤中。 在显微镜下，这些反应表现为点状荧光斑点，表明成功的PLA反应并提示两种抗原之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
【背景】近端连接测定法（PLA）是基于抗体的技术，以确定两种蛋白质是否彼此具有40nm。以这种方式检测到的蛋白质可以通过荧光来识别（Ho等人，2012; Banerjee等人，2015）。这使得PLA成为定位蛋白质 - 蛋白质相互作用的极好工具。 Toll样受体（TLR）途径的激活是致病性威胁的先天性免疫应答的重要组成部分。 TLR识别病原体相关分子并诱导信号级联以实现对感染的快速响应。 TLR2和TLR4是TLR家族的两个研究得非常好的成员，它们对不同的刺激有反应。尽管两种受体都响应细菌感染而激活，但只有TLR4响应脂多糖暴露。它们激活一些共享的信号级联，但包括MyD88 / Traf6通路。该途径的诱导包括形成被称为myddosome的信号复合物（Gay等人，2011; Xiong等人，2011; ...
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| Macrophage Inflammatory Assay
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Author:
Date:
2014-07-20
[Abstract] Macrophages represent a widely distributed and functionally diverse population of innate myeloid cells involved in inflammatory response to pathogens, tissue homeostasis and tissue repair (Murray and Wynn, 2011). Macrophages can be broadly grouped into two subpopulations with opposing activites: M1 or pro-inflammatory macrophages that promote T-helper type 1 (Th1) cell immunity and tissue damage, and M2 or anti-inflammatory/alternatively activated macrophages implicated in Th2 response and resolution of inflammation. Here we describe a rapid assay we used previously to monitor changes in pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine production by lipopolysaccharide (LPS)-activated macrophages in response to therapeutic paracrine factors produced by adult stem cells (Bartosh et al. ...
[摘要] 巨噬细胞代表广泛分布的和功能不同的先天骨髓细胞群，参与对病原体的炎症反应，组织内稳态和组织修复（Murray和Wynn，2011）。巨噬细胞可以大致分为具有相反活性的两个亚群：M1或促炎性巨噬细胞，其促进T辅助1型（Th1）细胞免疫和组织损伤，以及M2或抗炎或交替激活的巨噬细胞涉及Th2反应和分辨率的炎症。在这里我们描述了一种快速测定，我们以前用于监测由脂多糖（LPS）激活的巨噬细胞在响应于由成体干细胞产生的治疗性旁分泌因子的促炎和抗炎细胞因子产生中的变化（Bartosh等，/em>，2010; Ylostalo等人，2012; Bartosh 等人，2013）。该测定可以适当地适应于测试巨噬细胞对其它试剂的响应，在本文中将称为"测试试剂"或"测试化合物"。在该方案中，小鼠巨噬细胞细胞系J774A.1被扩增作为陪替氏培养皿上的粘附单层，允许容易地收获细胞而没有可以损伤细胞的酶或细胞刮擦器。然后用LPS悬浮刺激大孔，并接种到含有试验试剂的12孔细胞培养板中。 16-18小时后，收集由巨噬细胞调节的培养基，并用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定培养基中的细胞因子谱。我们常规测量促炎细胞因子TNF-α和抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）的水平。
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