| Investigating Localization of Chimeric Transporter Proteins within Chloroplasts of Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] In this protocol, we describe a method to design chimeric proteins for specific targeting to the inner envelope membrane (IEM) of Arabidopsis chloroplasts and the confirmation of their localization by biochemical analysis. Specific targeting to the chloroplast IEM can be achieved by fusing the protein of interest with a transit peptide and an IEM targeting signal. This protocol makes it possible to investigate the localization of chimeric proteins in chloroplasts using a small number of transgenic plants by using a modified method of chloroplast isolation and fractionation. IEM localization of chimeric proteins can be further assessed by trypsin digestion and alkaline extraction. Here, the localization of the chimeric bicarbonate transporter, designated as SbtAII, is detected by ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述了一种设计嵌合蛋白的方法，用于特异性靶向拟南芥叶绿体的内包膜（IEM）并通过生化分析确定它们的定位。 叶绿体IEM的特异性靶向可通过将感兴趣的蛋白质与转运肽和IEM靶向信号融合来实现。 这个协议使得有可能使用少量的转基因植物，通过使用修改的叶绿体分离和分离方法来研究嵌合蛋白在叶绿体中的定位。 嵌合蛋白的IEM定位可以通过胰蛋白酶消化和碱性提取进一步评估。 在此，称为SbtAII的嵌合碳酸氢根转运蛋白的定位通过使用针对葡萄球菌蛋白A的抗体进行蛋白质印迹来检测。该方案改编自上原等人，2016年
【背景】有人提出将蓝藻CO 2浓度机制整合到叶绿体中是改善C 3+植物光合作用的有希望的方法。 根据理论估计，将BicA和SbtA整合到叶绿体IEM中可以提高光合CO 2固定率。 我们研究了核编码的蓝细菌碳酸氢盐转运蛋白BicA和SbtA与拟南芥叶绿体的IEM的整合。 因此，我们制定了一个协议，设计嵌合构造为特定目标的IEM和调查嵌合蛋白在叶绿体中的定位。
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| Isolation, Culture and Differentiation of Adult Hippocampal Precursor Cells
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] There are two neurogenic niches in the adult mammalian brain: the subventricular zone of the lateral ventricle and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus. Cells from these areas can be isolated and maintained in vitro, using two different culture systems to assess their potential regarding proliferation and differentiation in a reductionist model. While the neurosphere assay is primarily performed to directly study the proliferative and differentiation potential of cells in individual brains, the monolayer culture allows single cell analysis in a rather homogeneous cell population. Here, we describe the isolation, culturing methods and differentiation of neural precursor cells in both systems.
[摘要] 成年哺乳动物脑中有两个神经生态位：侧脑室下脑室区和海马齿状回颗粒下区。 来自这些区域的细胞可以在体外分离和维持，使用两种不同的培养系统评估它们在还原模型中的增殖和分化的潜力。 虽然神经球测定主要是为了直接研究个体脑中细胞的增殖和分化潜能，单层培养允许在相当均匀的细胞群中进行单细胞分析。 在这里，我们描述了两个系统中的神经前体细胞的分离，培养方法和分化。
【背景】在哺乳动物脑中，成人神经干细胞存在于两个主要神经生态位中，即海马齿状回（DG）的下颗粒区（SGZ）和室下区（SVZ）的侧脑室，其允许新生神经元成人的大脑。来自神经生态位的神经前体细胞可以在体外分离和培养以模拟细胞过程，尤其是增殖和分化。两种标准培养系统，贴壁单层培养（Palmer等人，1995; Ray等人，1995）和神经球测定（Reynolds和Weiss，1992和1996 ）在20世纪90年代被引入，代表了在体外研究神经祖细胞生物学的有价值的工具。
根据研究问题，每个系统都有其优点和缺点，在选择其中一种或另一种培养方法之前应该仔细考虑。在贴壁单层培养中，细胞生长相当孤立，形成更均匀的培养物。单层允许直接调查和监测单细胞水平的神经前体细胞。受控条件下的形态，增殖和分化等特征可以很容易地分析和可视化。然而，与神经球培养物相比，以单层培养的细胞代表更复杂的模型，因为细胞通常以更少的通常存在于细胞壁中的细胞 ...
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| Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy.
[摘要] 该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法，并使用荧光显微镜对其进行可视化。
有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身，并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作（Coppin等人，1997）。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定（Tao和Scholey，2010）来观察，其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性，并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法（Tao等人，2006和2016）分析基于微管的运动蛋白功能。
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