| Purification and Identification of Novel Host-derived Factors for Influenza Virus Replication from Human Nuclear Extracts
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Author:
Date:
2016-09-20
[Abstract] Recently, we identified two host cell-derived proteins as novel stimulatory factors of influenza virus RNA replication process, termed “Influenza virus REplication Factor-2 (IREF-2)”, from human nuclear extracts (NEs) by employing biochemical complementation assays (Sugiyama et al., 2015). Herein, we describe detailed methods for successive procedures for identification and purification of IREF-2, including large-scale suspension culture of HeLa S3 cells, preparation of NEs and separation of IREF-2 by sequential column chromatography steps. This protocol can be modified and used for purification and identification of the other unknown nuclear protein(s) of your interest.
[摘要] 最近，我们通过使用生物化学互补试验（Sugiyama），从人类核提取物（NE）鉴定了两种宿主细胞衍生蛋白作为流感病毒RNA复制过程的新型刺激因子，称为“流感病毒复制因子-2（IREF-2）” et al。，2015）。 本文描述了用于IREF-2鉴定和纯化的连续方法的详细方法，包括HeLa S3细胞的大规模悬浮培养，NE的制备和顺序柱色谱步骤分离IREF-2。 该方案可以修改并用于纯化和鉴定您感兴趣的其他未知核蛋白。
【背景】甲型流感病毒基因组由8个分段和单链RNA（vRNA）组成。其转录和复制由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）催化。几条证据表明某些宿主衍生因子调节病毒RNA合成（Nagata et al。，2008）。最近，通过相互作用分析和基因组RNAi筛选研究，已经报道了各种宿主衍生的蛋白质作为与病毒RNA合成相关的调节因子候选物。然而，其中包括间接涉及病毒RNA合成的一些假阳性相互作用因子和因子。相反，为了鉴定在病毒RNA合成过程中发挥直接作用的可靠和重要的宿主因子，我们使用了生物化学互补测定系统。在该系统中，在感染的细胞核中有效发生的病毒vRNA复制反应被解剖并在体外使用病毒RNA复制所必需的病毒因子重构，例如衍生自洗涤剂溶解的病毒颗粒的病毒RdRP和模型病毒基因组RNA模板和未感染的核提取物（NE）。
最近，我们已经报道，在体外用病毒因子和NE的粗制部分再现有效的vRNA复制（Sugiyama等，2015）。 ...
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| Preparation of Mitochondria from Candida albicans
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Author:
Date:
2013-02-20
[Abstract] Based on the methods of (Daum et al., 1982) and (Hewitt et al., 2012), we have established the use of Candida albicans as a new model system to study mitochondrial biogenesis. This dimorphic yeast provides an excellent system to investigate the coordination of mitochondrial biogenesis with other cellular networks including cellular metabolism and the cell cycle. Unlike the model lab yeast Saccharomyces cerevisiae, which has been widely used in the mitochondrial biogenesis field, C. albicans is not subject to the Crabtree effect, hence grows aerobically in glucose when oxygen is present. Therefore the control of mitochondrial biogenesis in C. albicans is more typical of eukaryotic cells. C. albicans has a fully sequenced genome ...
[摘要] 基于（Daum等人，1982）和（Hewitt等人，2012）的方法，我们已经建立了白色念珠菌的使用作为研究线粒体生物发生的新模型系统。这种二聚酵母提供了一个优秀的系统来调查线粒体生物发生与其他细胞网络，包括细胞代谢和细胞周期的协调。不同于模型实验室酵母，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其已经广泛用于线粒体生物发生领域，白色素不受Crabtree效应的影响，因此当存在氧时在葡萄糖中有氧生长。因此在C中控制线粒体生物发生。白色念珠菌是更典型的真核细胞。 C。白色念珠菌具有完全测序的基因组，并且有许多公开的用于遗传操作促进系统生物学方法的工具。如本方案中所述的线粒体的分离产生更简化的系统，其可以使用分子生物学的标准工具来查询。此外，如方案中所述的放射性标记蛋白的导入： 白色念珠菌/em>线粒体蛋白质输入测定（Hewitt等人，2013）是一种敏感技术，其可用于确定进口蛋白质的动力学和相互作用的细节。
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