| HCV Reporter System (Viral Infection-Activated Split-Intein-Mediated Reporter System) for Testing Virus Cell-to-cell Transmission ex-vivo
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Hepatitis C virus (HCV) spread involves two distinct entry pathways: cell-free transmission and cell-to-cell transmission. Cell-to-cell transmission is not only an efficient way for viruses to spread but also an effective method for escaping neutralizing antibodies. We adapted the viral infection-activated split-intein-mediated reporter system (VISI) and developed a straightforward model for Live-cell monitoring of HCV cell-to-cell transmission ex-vivo: co-culture of HCV infected donor cells (red signal) with uninfected recipient cells (green signal) and elimination of the cell-free transmission by adding potent neutralizing antibody AR3A in the supernatant. With this model, the efficiency of cell-to-cell transmission can be evaluated by counting the number of foci designated by ...
[摘要] 丙型肝炎病毒（HCV）传播涉及两种不同的进入途径：无细胞传播和细胞间传播。 细胞间传播不仅是病毒传播的有效方式，也是逃避中和抗体的有效方法。 我们采用了病毒感染激活的分裂 - 内含肽介导的报告系统（VISI），并开发了一种直接模型，用于活细胞监测HCV细胞间传递离体：共培养 HCV感染的供体细胞（红色信号）与未感染的受体细胞（绿色信号）和通过在上清液中加入有效的中和抗体AR3A消除无细胞的传递。 利用该模型，可以通过计数受体细胞的绿色信号指定的病灶数来评估细胞间传递的效率。
【背景】越来越多的证据证明病毒可以在受感染的组织中使用不同的传播途径（Sattentau，2008; Zhong et al。，2013）。对于HCV传播，无细胞传播和细胞间传播均可介导肝细胞之间的病毒转移。虽然无细胞传播引发HCV感染，但认为细胞 - 细胞传递直接将HCV转移至相邻的肝细胞。它提供了抵抗中和抗体并有助于病毒持久性的极好方法（Brimacombe et al。，2011; Xiao et al。，2014）。之前的文章也证明了一些促进细胞传递的宿主因子，如清道夫受体BI（SR-BI），CD81，紧密连接蛋白claudin-1（CLDN1），Occludin（OCLN），表皮生长因子受体（EGFR）。 （Witteveldt et al。，2009; ...
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| Isolation and Cultivation of Primary Brain Endothelial Cells from Adult Mice
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Brain endothelial cells are the major building block of the blood-brain barrier. To study the role of brain endothelial cells in vitro, the isolation of primary cells is of critical value. Here, we describe a protocol in which vessel fragments are isolated from adult mice. After density centrifugation and mild digestion of the fragments, outgrowing endothelial cells are selected by puromycin treatment and grown to confluence within one week.
[摘要] 脑内皮细胞是血脑屏障的主要组成部分。 为了研究脑内皮细胞在体外的作用，原代细胞的分离是临床价值。 在这里，我们描述了一种方案，其中血管片段与成年小鼠分离。 在密度离心和片段的温和消化后，通过嘌呤霉素处理选择出生长的内皮细胞，并在一周内生长至汇合。
【背景】血脑屏障保护大脑免受细胞和物质的不受控制的侵入。 这主要是由脑内皮细胞形成的屏障组成的紧密和粘附连接限制细胞旁运输。
该方案被开发以克服维持其关键特征的小鼠脑内皮细胞系的有限可用性，例如表达足够量的紧密连接蛋白如闭合蛋白，ZO-1或紧密连接蛋白-5以诱导高跨内皮细胞抗性。
此外，从内含基因修饰的小鼠中分离脑内皮细胞可以在体外研究基因特异性功能。
使用这种方法，我们以前补充了体内研究，证明NF-κB信号在脑内皮细胞中维持正常血脑屏障功能的重要性（Ridder等，2015）。
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| Creating a RAW264.7 CRISPR-Cas9 Genome Wide Library
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 genome editing tools are used in mammalian cells to knock-out specific genes of interest to elucidate gene function. The CRISPR-Cas9 system requires that the mammalian cell expresses Cas9 endonuclease, guide RNA (gRNA) to lead the endonuclease to the gene of interest, and the PAM sequence that links the Cas9 to the gRNA. CRISPR-Cas9 genome wide libraries are used to screen the effect of each gene in the genome on the cellular phenotype of interest, in an unbiased high-throughput manner. In this protocol, we describe our method of creating a CRISPR-Cas9 genome wide library in a transformed murine macrophage cell-line (RAW264.7). We have employed this library to identify novel mediators in the caspase-11 ...
[摘要] 细菌聚集的定期交织的短回文重复（CRISPR）-Cas9基因组编辑工具用于哺乳动物细胞敲除感兴趣的特定基因以阐明基因功能。 CRISPR-Cas9系统要求哺乳动物细胞表达Cas9核酸内切酶，引导RNA（gRNA）引导内切核酸酶到目的基因，以及连接Cas9与gRNA的PAM序列。使用CRISPR-Cas9基因组宽的文库以无偏倚的高通量方式筛选基因组中每个基因对感兴趣的细胞表型的影响。在本协议中，我们描述了我们在转化的鼠巨噬细胞细胞系（RAW264.7）中创建CRISPR-Cas9基因组文库的方法。我们已经使用该文库来鉴定胱天蛋白酶-11细胞死亡途径中的新型介质（Napier等人，2016）;然而，该文库可用于筛选特定基因在多种鼠巨噬细胞通路中的重要性。
背景 历史上，使用RNA干扰（RNAi）或源自敲除小鼠的细胞，了解特定基因对真核细胞中感兴趣的表型的贡献是可能的。然而，在过去几年中，新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9已经允许在真核细胞内容易且有效地产生敲除细胞系和全基因组筛选。 CRISPR-Cas9基因组范围的筛选扩大了哺乳动物遗传学的工具箱和新型蛋白质的鉴定及其对特定表型的贡献。使用这种方法，研究人员已经能够鉴定参与肿瘤生长的新基因（Chen等人，2015; Kiessling等人，2016; Steinhart ...
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