| Staining of Membrane Receptors with Fluorescently-labeled DNA Aptamers for Super-resolution Imaging
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] One of the most prominent applications of fluorescent super-resolution microscopy is the study of nanodomain arrangements of receptors and the endocytic pathway. Staining methods are becoming crucial for answering questions on the nanoscale, therefore, the use of small and monovalent affinity probes is of great interest in super-resolution microscopy with biological samples. One kind of affinity probe is the aptamer. Aptamers are single DNA or RNA sequences that bind with high affinity to their targets and due to their small size they are able to (i) place the fluorophore in close proximity to the protein of interest and (ii) bind to most of the protein of interest overcoming the steric hindrance effect, resulting in better staining density. Here we describe a detailed protocol with which ...
[摘要] 荧光超分辨率显微镜的最突出的应用之一是研究纳米结构的受体和内吞途径。染色方法对于回答纳米尺度的问题变得至关重要，因此，使用小型和单价亲和探针在具有生物样品的超分辨显微镜中是非常有意义的。一种亲和力探针是适体。适配体是以高亲和力结合其靶标的单个DNA或RNA序列，并且由于它们的小尺寸，它们能够（i）将荧光团置于感兴趣的蛋白质附近，并且（ii）与大部分蛋白质结合有利于克服空间位阻效应，导致更好的染色密度。在这里，我们描述一个详细的协议，使用适配体染色活细胞，并用刺激的排放消耗（STED）显微镜对其进行成像。在该方案中，染色用市售适用于靶向表皮生长因子受体（EGFR），人表皮生长因子受体2（HER2或ErbB2）和ephrin-A受体2（Epha2）的适体进行。由于适配体可与大部分受欢迎的荧光团偶联，因此我们认为本文介绍的方法可扩展到目前超分辨率显微镜技术的绝大多数。
【背景】超分辨率成像技术的最新进展已经导致搜索更精确的方法来标记细胞元件。衍射无限成像仪器提供优异的分辨率，然而标准样品染色方法，如免疫染色，缺乏检测细胞元素所必需的精度。由于它们的大尺寸（长度约15nm）和高分子量（〜150kDa），抗体可以很差地渗透到生物样品中。另外，一次/二次抗体复合物将荧光团放置在远离靶的大约25nm处，从而损害检测精度。此外，由于初级/二级抗体复合物的大尺寸，由于空间位阻（Fornasiero和Opazo，2015），较小部分的靶标可以被标记。这导致较低的标记密度，这是超分辨率显微镜的关键参数，特别是在识别和描述纳米结构时。为了克服这些问题，近年来已经测试了与单个靶（单价）结合的小的亲和力探针，如适体，亲和体或纳米体系（Rothbauer ...
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| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Specific Enrichment
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Author:
Date:
2012-08-05
[Abstract] 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) is a newly discovered DNA modification in mammalian genomes. This protocol is to be a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically, which could in turn be used for high-throughput mapping via next-generation sequencing.
[摘要] 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）是哺乳动物基因组中新发现的DNA修饰。 这个协议是一种高效和选择性的化学方法来标记和捕获5-hmC，利用噬菌体酶，特别是添加葡萄糖部分到5-hmC，这可以反过来用于高通量映射通过下一个 - 生成测序。
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