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PIPES

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Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: P6757
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Metal-tagging Transmission Electron Microscopy for Localisation of Tombusvirus Replication Compartments in Yeast
Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract]  Positive-stranded (+) RNA viruses are intracellular pathogens in humans, animals and plants. To build viral replicase complexes (VRCs) viruses manipulate lipid flows and reorganize subcellular membranes. Redesigned membranes concentrate viral and host factors and create an environment that facilitates the formation of VRCs within replication organelles. Therefore, efficient virus replication depends on the assembly of specialized membranes where viral macromolecular complexes are turned on and hold a variety of functions. Detailed characterization of viral replication platforms in cells requires sophisticated imaging approaches. Here we present a protocol to visualize the three-dimensional organization of the tombusvirus replicase complex in yeast with MEtal-Tagging Transmission Electron ... [摘要]  正链(+)RNA病毒是人,动物和植物中的细胞内病原体。构建病毒复制酶复合物(VRC)病毒操纵脂质流动和重组亚细胞膜。重新设计的膜集中了病毒和宿主因子,并创造了促进复制细胞器内VRC形成的环境。因此,有效的病毒复制取决于病毒大分子复合物开启并具有各种功能的特殊膜的组装。细胞中病毒复制平台的详细特征需要复杂的成像方法。在这里我们提出一个协议,用肉眼标记透射电子显微镜(METTEM)可视化酵母中的tombusvirus复制酶复合物的三维组织。该协议使我们能够用METTEM和电子断层扫描成像三维病毒复制酶分子的细胞内分布。我们的研究显示病毒复制酶分子如何在特化细胞膜内构建复制复合物。

【背景】正链RNA病毒的复制取决于细胞膜的重塑。细胞内膜作为VRC装配的结构支架,提供调节病毒复制酶活性和保护病毒RNA免受宿主抗病毒防御的必需脂质和辅因子(Miller和Krijnse-Locker,2008; den Boon <等,2010; nagy和pogany,2011;="" nagy,2016)。电子显微镜观察到具有活性vrc的复制细胞器的结构。="" vrc以单个膜囊或'小球',管状球形立方体膜,双膜囊泡(dmv)或平面寡聚体阵列装配(de="" castro等人,2013)。通常在rna病毒感染的细胞中观察到小球。它们通过在各种细胞器中内陷而形成,并具有对胞质溶胶的狭窄开口(den="" boon="" et=""> ...

Immunogold Localization of Molecular Constituents Associated with Basal Bodies, Flagella, and Extracellular Matrices in Male Gametes of Land Plants
Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract]  Male gametes (spermatozoids) are the only motile cells produced during the life cycle of land plants. While absent from flowering and most cone-bearing plants, motile cells are found in less derived taxa, including bryophytes (mosses, liverworts and hornworts), pteridophytes (lycophytes and ferns) and some seed plants (Ginkgo and cycads). During development, these cells undergo profound changes that involve the production of a locomotory apparatus, unique microtubule (MT) arrays, and a series of special cell walls that are produced in sequence and are synchronized with cellular differentiation. Immunogold labeling in the transmission electron microscope (TEM) provides information on the exact location and potential function of macromolecules involved with this developmental ... [摘要]  雄性配子(精子)是陆地植物生命周期中唯一产生的运动细胞。虽然没有开花和大多数含有锥体的植物,但在少量来源的分类群中发现运动细胞,包括苔藓植物(苔藓,苔草和horn)),蕨类植物(石膏植物和蕨类植物)和一些种子植物(银杏,苏铁)。在发育过程中,这些细胞发生深刻的变化,涉及生产运动装置,独特的微管(MT)阵列和一系列特定的细胞壁,这些细胞壁依次产生并与细胞分化同步。透射电子显微镜(TEM)中的免疫金标记提供了涉及该发育过程的大分子的确切位置和潜在功能的信息。具体而言,可能将表位定位于与涉及MT产生和功能的细胞内含物相关的蛋白质。在这些植物中的精子发生对于检查构成细胞外基质的碳水化合物和糖蛋白的差异表达也是理想的,所述细胞外基质与配子形状和运动装置发育中的戏剧性建筑变化相关。在这里我们提供使用单克隆抗体(MAbs)和透射电子显微镜中免疫金标记的方法来定位精子发育不可或缺的大分子。

【背景】动植物的陆地植物是惊人的多样化,鞭毛数量从2到4万以上(Renzaglia和Garbary,2001)。在一系列同心的有丝分裂分裂内,新生精细胞(精细胞)在一个动态和生长的细胞壁的范围内经历一系列的发育变化。当细胞器重新定位和成形时,产生复杂的运动装置并且鞭毛在细胞周围伸长。同步开发在一个单一的天竺鼠中,在一个单一的成熟阶段和不同的剖面中产生数百个细胞。

这种深刻的细胞分化涉及独特的MT阵列的发展,样条和鞭毛,从离散的微管组织中心(MTOCs),唯一含有中心粒的中心体在陆地植物散发。由于基因体,鞭毛及相关复合体在发育中的雄性配子中的独家出现,精子发生的研究揭示了MT阵列的结构,组成和发育变化的重要信息,因为它们涉及细胞周期,MTOC和细胞分化(Joshi等人,1992; ...

Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract]  The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy. [摘要]  该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法,并使用荧光显微镜对其进行可视化。

有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身,并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作(Coppin等人,1997)。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定(Tao和Scholey,2010)来观察,其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性,并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法(Tao等人,2006和2016)分析基于微管的运动蛋白功能。

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