| A Modified Semisolid Clonal Culture for Identification of B-1 and B-2 Progenitor Colony Forming Ability of Mouse Embryonic Hemogenic Endothelial Cells
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] The search for the origin of the first hematopoietic stem cells (HSCs) in the mouse embryo has been a hot topic in the field of developmental hematopoiesis. Detecting lymphoid potential is one of the supportive evidence to show the definitive hematopoietic activity of HSCs. However, the first B-lymphoid potential in the mouse embryos are reported to be biased to innate-like B-1 cell lineage that can develop from hemogenic endothelial cells (HECs) independently of HSCs. On the other hand, conventional adaptive immune B cells (B-2) cells are considered to be exclusively derived from HSCs. Therefore, segregating B-1 and B-2 progenitor potential is important to understand the developmental process of HSCs that are also produced from HECs through intermediate precursors referred to as ...
[摘要] [摘要 ] 在搜索起源的第一造血干细胞（HSCs）在小鼠胚胎一直是一个热门话题在该领域发展造血功能。检测淋巴潜力是一个支持性证据显示权威造血活动的造血干细胞然而，据报道，小鼠胚胎中的第一个B淋巴样电位偏向于先天性B-1细胞谱系，该谱系可以从造血内皮细胞（HEC）脱离HSC发育而来。 B细胞（B-2）细胞被认为仅来自HSC。因此，分离B-1和B-2祖细胞的潜力对于理解也由HEC通过中间前体（也称为HEC）产生的HSC的发育过程非常重要。 HECs和pre-HSCs均显示pre-HSCs显示内皮表面表型并需要基质支持以检测其造血活性。利用基质细胞培养后再进行改良的半固体克隆培养的方法使我们能够检测B-1的菌落形成单位数量/ B-2祖细胞最初源自HEC / HSC之前的细胞，将反映B-1偏倚或多谱系繁殖的HSC的潜力。
[背景 ] 半固体克隆培养（甲基纤维素集落形成测定法）是检测造血祖细胞数量的传统方法。一个集落被认为是来自单个祖细胞（克隆来源），添加的细胞因子在细胞的形成中起着重要作用。产量菌落，例如Epo增强了红细胞的菌落形成单位（CFU-E）或红细胞的爆发形成单位（BFU-E），而G-CSF / GM-CSF将增强CFU-G（粒细胞），M ...
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| An in vitro Co-culture System for the Activation of CD40 by Membrane-presented CD40 Ligand versus Soluble Agonist
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] One fundamental property of the TNR receptor (TNFR) family relates to how ‘signal quality’ (the extent of receptor ligation or cross-linking) influences the outcome of receptor ligation, for instance the induction of death in tumour cells. It is unequivocal that membrane-presented ligand (delivered to target cells via cell-surface presentation by co-culture with ligand-expressing third-party cells) induces a greater extent of carcinoma cell death in vitro in comparison to non-cross-linked agonists (agonistic antibodies and/or recombinant ligands). The CD40 receptor epitomises this fundamental property of TNF receptor-ligand interactions, as the extent of CD40 cross-linking dictates cell fate. Membrane-presented CD40 ligand (mCD40L), but not soluble agonists (e.g., ...
[摘要] TNR受体（TNFR）家族的一个基本特性涉及“信号质量”（受体连接或交联的程度）如何影响受体连接的结果，例如肿瘤细胞中的死亡诱导。毫无疑问，膜呈递配体（通过与表达配体的第三方细胞共培养通过细胞表面呈递递送至靶细胞）在体外诱导更大程度的癌细胞死亡非交联激动剂（激动性抗体和/或重组配体）。 CD40受体集中体现了TNF受体 - 配体相互作用的这种基本特性，因为CD40交联的程度决定了细胞命运。膜呈递CD40配体（mCD40L），但不是可溶性激动剂（例如，激动性抗CD40抗体），诱导高水平的促炎细胞因子分泌并导致恶性肿瘤细胞广泛死亡（细胞凋亡）但不是正常的）上皮细胞。在本文中，我们描述了通过mCD40L激活CD40并随后检测细胞凋亡的各种特征（包括细胞膜透化，DNA片段化，半胱天冬酶活化）以及细胞内细胞死亡介质检测的共培养系统（包括衔接蛋白，促凋亡激酶和活性氧，ROS）。
【背景】TNFR及其配体在调节淋巴组织以及上皮（尤其是癌）细胞中的细胞增殖或死亡中的作用已经在广泛研究中，因为它们诱导细胞死亡（主要通过细胞凋亡）的能力代表了有希望的目标。用于癌症治疗。然而，重要的是，当以可溶性对膜结合形式存在时，TNFR激动剂引发细胞死亡的能力存在明显差异。当作为单独治疗施用时，可溶性激动剂通常表现出相对低的细胞毒性效力，而膜呈递的配体似乎是优越的（Albarbar ...
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| γ-Secretase Epsilon-cleavage Assay
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] γ-Secretase epsilon-cleavage assay is derived from the cell-based Tango assay (Kang et al., 2015), and is a fast and sensitive method to determine the initial cleavage of C99 by γ-secretase. In this protocol, we use HTL cells, which are HEK293 cells with a stably integrated luciferase reporter under the control of the bacterial tetO operator element, in which C99 C terminally fused to a reversed tetracyclin-inducible activator (rTA) transcriptional activator is expressed. Endogenous or transfected γ-secretase cleaves a C terminally fused rTA transcriptional activator from C99, allowing rTA to move to the nucleus to activate a luciferase reporter gene as a measurement for γ-secretase cleavage activity.
[摘要] γ-分泌酶ε-切割测定来源于基于细胞的Tango测定法（Kang等人，2015），并且是确定γ-分泌酶对C99的初始切割的快速且灵敏的方法。 在该协议中，我们使用HTL细胞，其是在细菌tetO操纵元件的控制下具有稳定整合的萤光素酶报道基因的HEK293细胞，其中C99C末端融合至反向四环素诱导型活化剂（rTA）转录激活剂。 内源性或转染的γ-分泌酶从C99切割C末端融合的rTA转录激活物，允许rTA移动到核以激活萤光素酶报道基因作为γ-分泌酶切割活性的测量。
【背景】阿尔茨海默病（AD）是最普遍的慢性神经退行性疾病。 AD与淀粉样斑块的形成密切相关。这些斑块主要由聚集的β淀粉样蛋白组成，β淀粉样蛋白是由γ-分泌酶裂解淀粉样蛋白前体蛋白的C端99个氨基酸片段（C99）产生的。尽管进行了广泛的努力，γ-分泌酶如何识别其底物尚不清楚。通过将TEV切割位点和转录激活子工程化至GPCR的胞质C末端并连接TEV蛋白酶，设计常规Tango测定以监测GPCR的活化（Barnea等人，2008）到人β-arrestin2。在这里，我们使用内源性或转染的γ-分泌酶切割其底物的跨膜部分，即C99的C末端与rTA融合以建立γ-分泌酶Epsilon切割测定（图1） 。首先建立该测定法以研究γ-分泌酶对C99的初始裂解（Xu等人，2016）。
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