| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of other putative polyamine transporters, such as isoforms of the P5B transport ATPases.
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| Histone Deubiquitination Assay in Nicotiana benthamiana
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Histone modifications are a group of post-translational modifications on histones which can alter chromatin structure and affect gene expression. Histone ubiquitination is a histone modification found in particular on histone H2A and H2B. Histone ubiquitination can be reversed by ubiquitin-specific proteases (UBP). Here, we describe an in vivo assay for histone deubiquitination activity. After infiltrating UBP12 into Nicotiana benthamiana leaves, H2Aub was visualized by immunocytochemistry. Nicotiana benthamiana leaves, which show high agro infiltration efficiency, were used for transient UBP12 expression for a labor- and time-saving protocol. Reduced H2Aub levels indicated histone deubiquitination activity of UBP12. The clear visualization of nuclei of N. ...
[摘要] 组蛋白修饰是一组组蛋白翻译后修饰，可以改变染色质结构并影响基因表达。组蛋白泛素化是组蛋白H2A和H2B特异性发现的组蛋白修饰。泛素特异性蛋白酶（UBP）可以逆转组蛋白泛素化。在这里，我们描述了组蛋白去泛素化活性的体内试验。在将UBP12渗入烟草叶片中后，通过免疫细胞化学观察H2Aub。表现出高的农业渗透效率的本氏烟草叶用于瞬时UBP12表达，用于节省劳力和时间的方案。 H2Aub水平降低表明UBP12的组蛋白去泛素化活性。 N的核的清晰可视化。本生叶使得该方法能够通过使用特异性抗体容易地测量体内组蛋白修饰的水平，从而提供强大的蛋白质功能线索。因此，该协议是组蛋白去泛素化活性的体外试验的有力补充。
【背景】组蛋白修饰在调节染色质结构和基因表达中发挥重要作用。 研究最深入的组蛋白修饰包括甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化和sumoylation。 然而，引入或去除特定组蛋白修饰的酶并不总是已知的。 强大的体外试验可以确定组蛋白修饰酶的催化潜能，但是体内试验方法对于确认体外试验的特异性反映抗体的特异性是必要的。 体内活动。 在这里，我们描述了一个灵活的协议来测试植物组织中组蛋白修饰酶的活性。本塞姆氏。 尽管我们使用该方案来测试遍在蛋白特异性蛋白酶（UBP）对泛素化H2A的活性，但它也可以容易地用于其他特异性抗体可用的组蛋白修饰。
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| Chromatin Affinity Purification (ChAP) from Arabidopsis thaliana Rosette Leaves Using in vivo Biotinylation System
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Author:
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2018-01-05
[Abstract] Chromatin Affinity Purification (ChAP) is widely used to study chromatin architecture and protein complexes interacting with DNA. Here we present an efficient method for ChAP from Arabidopsis thaliana rosette leaves, in which in vivo biotinylation system is used. The chromatin is digested by Micrococcal Nuclease (MNase), hence the distribution of nucleosomes is also achieved. The in vivo biotinylation system was initially developed for Drosophila melanogaster (Mito et al., 2005), but the presented protocol has been developed specifically for Arabidopsis thaliana (Sura et al., 2017).
[摘要] 染色质亲和纯化（ChAP）被广泛用于研究染色质结构和与DNA相互作用的蛋白质复合物。 在这里，我们提出了一种有效的从拟南芥莲座叶中ChAP的方法，其中使用了体内生物素化系统。 染色质被Micrococcal核酸酶（MNase）消化，因此核小体的分布也被实现。 体内生物素化系统最初是为黑腹果蝇而开发的（Mito et al。2005），但是所提出的方案是专门为 拟南芥（Sura et。，2017）。
【背景】染色质免疫沉淀（ChIP）成为研究染色质结构和组织的最重要和最常用的技术之一。但是，它需要高质量的抗体，不会与非特异性靶标发生交叉反应。在含有细胞壁并富含光合作用相关化合物和蛋白质的植物中，这是相当难以实现的，这些化合物和蛋白质经常引起交叉反应性问题。另一方面，获得稳定的转基因生物是植物常规和容易的策略。由于这些原因，大多数植物研究人员选择基因标签，获得融合蛋白，并用ChIP替代方法即染色质亲和纯化（ChAP）来研究染色质。 ChAP技术已被证明在植物染色质研究中非常有效（Zentner和Henikoff，2014）。此外，它通常比经典ChIP便宜，因为它不需要产生抗体，并且通常比ChIP更有效，因为标签以比直接针对感兴趣的蛋白质产生的抗体更高的亲和力被识别。 ...
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