| Nucleosome Positioning Assay
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The basic unit of chromatin is the nucleosome, a histone octamer with 147 base pairs of DNA wrapped around it. Positions of nucleosomes relative to each other and to DNA elements have a strong impact on chromatin structure and gene activity and are tightly regulated at multiple levels, i.e., DNA sequence, transcription factor binding, histone modifications and variants, and chromatin remodeling enzymes (Bell et al., 2011; Hughes and Rando, 2014). Nucleosome positions in cells or isolated nuclei can be detected by partial nuclease digestion of native or cross-linked chromatin followed by ligation-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) (McPherson et al., 1993; Soutoglou and Talianidis, 2002). This protocol describes a nucleosome positioning assay using ...
[摘要] 染色质的基本单位是核小体，一个组织蛋白八聚体，其中包含147个碱基对的DNA。核小体相对于彼此和DNA元件的位置对染色质结构和基因活性具有强烈的影响，并且在多个水平（例如，DNA序列，转录因子结合，组蛋白修饰和变体）和染色质重塑酶（Bell et al。，2011; Hughes和Rando，2014）。可以通过天然或交联染色质的部分核酸酶消化，然后连接介导的聚合酶链反应（LM-PCR）（McPherson等人，1993; Soutoglou）检测细胞或分离的核中的核小体位置和Talianidis，2002）。该方案描述了使用微球菌核酸酶（MNase）消化甲醛固定染色质，然后进行LM-PCR的核小体定位测定。我们举例说明了在小鼠中编码核糖体RNA（rRNA基因或rDNA）的基因启动子的核小体定位测定，其具有两个相互排斥的配置。 rDNA启动子含有相对于转录起始位点的核苷酸-157至-2或位于-132位的下游核小体（NucD ）的上游核小体（NucU ）至+22（Li等人，2006; Xie等人，2012）。 LM-PCR产物的放射性标记，然后变性尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，允许两种配置的分辨和相对定量。如图1所示，核小体定位测定是通用的低至中等通量的方法，以半定量方式以高精度映射离散的核小体位置。
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| Analysis of Replicative Intermediates of Adeno-associated Virus through Hirt Extraction and Southern Blotting
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV) is a small single-stranded DNA virus that requires the presence of a helper virus, such as adenovirus or herpes virus, to efficiently replicate its genome. AAV DNA is replicated by a rolling-hairpin mechanism (Ward, 2006), and during replication several DNA intermediates can be detected. This detailed protocol describes how to analyze the AAV DNA intermediates formed during AAV replication using a modified Hirt extract (Hirt, 1967) procedure and Southern blotting (Southern, 1975).
[摘要] 腺相关病毒（AAV）是一种小型单链DNA病毒，需要存在辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒，以有效地复制其基因组。 AAV DNA通过滚转发夹机制（Ward，2006）进行复制，并且在复制期间可以检测出几种DNA中间体。该详细方案描述了如何使用改良的Hirt提取物（Hirt，1967）程序和Southern印迹（Southern，1975）分析在AAV复制期间形成的AAV DNA中间体。
背景 AAV DNA复制通过滚动发夹机制在由AAV和辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染的细胞中进行（Ward，2006）。 AAV DNA由4.7kb的线性DNA分子和倒置的末端重复（ITR）组成，折叠形成T形发夹结构。 3'末端发夹作为AAV DNA复制的引物。这些发夹结构由AAV Rep蛋白再生，允许进一步复制（Im和Muzyczka，1990）。 AAV DNA的+和 - 链都被包装并且是感染性的（Rose等人，1969）。当分析复制AAV DNA时，可以检测到几种复制中间体（Straus等人，1976）。最丰富的复制中间体是由AAV DNA的一个和一个链形成的线性单体双链体分子，其被认为是将包装在预先形成的衣壳中的后代单链分子的直接前体（Straus ，1976）。二聚体复制中间体也是常见的，AAV复制模型与甚至更大的复制中间体相容。 ...
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