| Macrophage Survival Assay Using High Content Microscopy
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Macrophages maintain tissue homoeostasis by regulating inflammation and tissue repair mechanisms. Thus, the fate of macrophages has an impact on the state of the tissue. The aim of this protocol is to quantify macrophage survival using high content microscopy and image processing software. Here, we describe a high-content image based protocol to assess the effect of diverse stimuli in combination with pharmacological treatments on macrophage survival in a quantitative, unbiased and high-throughput manner.
[摘要] 巨噬细胞通过调节炎症和组织修复机制来维持组织均匀平衡。 因此，巨噬细胞的命运对组织的状态有影响。 该方案的目的是使用高含量显微镜和图像处理软件来量化巨噬细胞存活。 在这里，我们描述了一种基于高含量图像的方案，以定量，无偏差和高通量方式评估不同刺激与药理学治疗对巨噬细胞存活的影响。
【背景】巨噬细胞是吞噬先天免疫细胞，是组织炎症的主要驱动因素（Medzhitov，2008）。 这些细胞与自身免疫，自身炎症，感染性，神经变性和代谢性疾病一起与癌症相关（Ginhoux和Jung，2014）。 在这种情况下，巨噬细胞在炎症中的作用得到了很好的研究，然而，非传染性和感染性疾病中巨噬细胞存活的影响在很大程度上是未知的。 我们的研究表明，某些病原体相关受体（PRR）的激活可以诱导巨噬细胞存活（Eren等，2016）。 我们描述了一种分子机制，证明专门的细胞内病原体如何利用PRR诱导的细胞存活（Eren等，2016）。 因此，需要进一步的研究来了解巨噬细胞存活在不同疾病环境中的作用。
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| Selection of Genetically Modified Bacteriophages Using the CRISPR-Cas System
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] We present a CRISPR-Cas based technique for deleting genes from the T7 bacteriophage genome. A DNA fragment encoding homologous arms to the target gene to be deleted is first cloned into a plasmid. The T7 phage is then propagated in Escherichia coli harboring this plasmid. During this propagation, some phage genomes undergo homologous recombination with the plasmid, thus deleting the targeted gene. To select for these genomes, the CRISPR-Cas system is used to cleave non-edited genomes, enabling isolation of the desired recombinant phages. This protocol allows seamless deletion of desired genes in a T7 phage, and can be expanded to other phages and other types of genetic manipulations as well.
[摘要] 我们提出了一种用于从T7噬菌体基因组中删除基因的基于CRISPR-Cas的技术。 首先将编码与待缺失的靶基因的同源臂的DNA片段克隆到质粒中。 然后将T7噬菌体在携带该质粒的大肠杆菌中繁殖。 在这种繁殖期间，一些噬菌体基因组与质粒进行同源重组，从而缺失靶基因。 为了选择这些基因组，CRISPR-Cas系统用于切割未编辑的基因组，从而能够分离所需的重组噬菌体。 该协议允许在T7噬菌体中无缝地删除所需的基因，并且可以扩展到其它噬菌体和其他类型的遗传操作。
【背景】噬菌体（噬菌体）是生物圈中最普遍和广泛分布的生物实体，突出了它们的生态重要性（Suttle，2007）。许多研究还提出将噬菌体用于医疗目的（Weber-Dabrowska等人，2001; Merril等人，2003; Harper和Enright，2011; Edgar ，2012; Bikard等人，2014; Citorik等人，2014; Yosef等人， 2014年和2015年）。不幸的是，仅有少数公开的方法详细描述了噬菌体基因组学的基因工程（Selick等人，1988; Marinelli等人，2008; ...
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| Gene Dosage Experiments in Enterobacteriaceae Using Arabinose-regulated Promoters
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] This protocol is used to assay the effect of protein over-expression on fitness of E. coli. It is based on a plasmid expression of a protein of interest from an arabinose-regulated pBAD promoter followed by the measurement of the intracellular protein abundance by Western blot along with the measurement of growth parameters of E. coli cell expressing this protein.
[摘要] 该方案用于测定蛋白质过表达对E适应度的影响。大肠杆菌。 它基于来自阿拉伯糖调节的pBAD启动子的目的蛋白的质粒表达，随后通过Western印迹测量细胞内蛋白质丰度以及E的生长参数的测量。 表达该蛋白质的大肠杆菌细胞。
【背景】基因剂量实验对于了解蛋白质过表达对健康的影响和确定蛋白质丰度的最佳水平至关重要。 几个基因即使在非常低的水平表达也是有毒的。 因此，重要的是从紧密调节的启动子表达蛋白质以使渗漏表达最小化。 在这里，我们已经阐明了在良好表征的阿拉伯糖诱导的pBAD启动子下的蛋白质表达的条件，并且设计了用于测量E细胞内丰度和适应度的方案。 含有过表达质粒的大肠杆菌细胞。
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