| Methylation-sensitive Amplified Polymorphism as a Tool to Analyze Wild Potato Hybrids
|
|
Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism (MSAP) is a versatile marker for analyzing DNA methylation patterns in non-model species. The implementation of this technique does not require a reference genome and makes it possible to determine the methylation status of hundreds of anonymous loci distributed throughout the genome. In addition, the inheritance of specific methylation patterns can be studied. Here, we present a protocol for analyzing DNA methylation patterns through MSAP markers in potato interspecific hybrids and their parental genotypes.
[摘要] [摘要]甲基化敏感扩增多态性(MSAP)是一种用于分析非模型物种DNA甲基化模式的多功能标记。这种技术的实施不需要参考基因组，并且可以确定分布在整个基因组中的数百个匿名位点的甲基化状态。此外，特定甲基化模式的遗传可以被研究。在这里，我们提出了通过MSAP标记分析马铃薯种间杂交种及其亲本基因型的DNA甲基化模式的协议。
[背景]核苷酸序列并不是基因组信息的唯一形式，DNA甲基化、组蛋白、修改DNA上的组蛋白和核苷酸残基的酶，甚至RNA，都会影响基因的活动，并为细胞提供另一层指令。DNA甲基化、组蛋白、修改组蛋白的酶和DNA上的核苷酸残基，甚至RNA，都会影响基因活动，并为细胞提供另一层指令。表观遗传学变化，也称为表观遗传，可以遗传，并具有重要的表型后果。在植物中，甲基化反应将胞嘧啶残基修饰成5-甲基胞嘧啶。这种表观遗传机制对于维持基因组的完整性是至关重要的，并有助于调节基因在发育过程中的表达以及对生物和非生物胁迫的反应。此外，DNA甲基化的变化是由杂交和多倍体化等基因组冲击引发的，这是植物进化过程中的两个重要现象（Cara et al., 2019)。
有各种不同的方法来研究DNA甲基化的变化。可以使用高效液相色谱法(HPLC)评估全局性的胞嘧啶甲基化，这种分析方法可以量化胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，并计算基因组中甲基化残基的百分比。对于研究基因组上特定位置的DNA甲基化，可以提到两种选择。一种是使用对限制性位点胞嘧啶甲基化具有不同敏感性的异构体。例如，甲基化敏感扩增多态性(MSAP)标记表征来自随机基因组DNA的匿名5′-CCGG序列处的甲基化模式。这是对原始AFLP协议的改编(Voset ...
|
|
|
| RNA Capping by Transcription Initiation with Non-canonical Initiating Nucleotides (NCINs): Determination of Relative Efficiencies of Transcription Initiation with NCINs and NTPs
|
|
Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] It recently has been established that adenine-containing cofactors, including nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), and 3’-desphospho-coenzyme A (dpCoA), can serve as ‘non-canonical initiating nucleotides’ (NCINs) for transcription initiation by bacterial and eukaryotic cellular RNA polymerases (RNAPs) and that the efficiency of the reaction is determined by promoter sequence (Bird et al., 2016). Here we describe a protocol to quantify the relative efficiencies of transcription initiation using an NCIN vs. transcription initiation using a nucleoside triphosphate (NTP) for a given promoter sequence.
[摘要] 最近已经确定，含有腺嘌呤的辅因子，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +），还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和3'-脱磷酸辅酶A（dpCoA）可以作为“非规范起始核苷酸” NCIN），用于通过细菌和真核细胞RNA聚合酶（RNAP）进行转录起始，并且通过启动子序列确定反应的效率（Bird等，2016）。 在这里，我们描述了使用NCIN与使用三磷酸核苷（NTP）对于给定启动子序列的转录起始来定量转录起始的相对效率的方案。
【背景】在细菌，古细菌和真核生物中的转录由序列，结构和机制保守的多亚基RNA聚合酶（RNAPs）进行（Ebright，2000; Lane和Darst，2010）。为了启动转录，RNAP与一个或多个引发因子一起结合称为“启动子”的特异性DNA序列，并解开启动子DNA以形成含有未解链“转录泡”的RNAP启动子开放复合物（RPo）（图1A; Ruff等人，2015）。 RNAP然后通过扩增（“剔除”）或收缩（“抗锯齿”）转录起始点来选择转录起始位点，以将转录起始位点的核苷酸置于RNAP活性中心起始位点（“i位点”）和扩增位点'i + 1位点'）结合i位点的互补起始核苷酸底物和“i + 1”位点的互补延伸底物，并催化磷酸二酯键形成产生初始RNA产物（Winkelman等， 2016）。
在标准的从头转录启动中，起始底物是核苷三磷酸（NTP），通常为ATP或GTP（Nickels ...
|
|
|
| Preparation and Analysis of Crude Autolytic Enzyme Extracts from Staphylococcus aureus
|
|
Author:
Date:
2015-12-20
[Abstract] The metabolism of the cell surface during bacterial cell division involves synthesis and degradation of peptidoglycan (PGN), the major component of the bacterial cell wall. Bacteria have to ensure that their surface remains capable of withstanding high turgor pressures and, simultaneously, that the PGN at their surface is concealed from receptors produced by the host innate immune system. For cell separation to occur, and for PGN to be kept concealed, “old” PGN is degraded by specific PGN hydrolases, also known as autolysins, that are found at the bacterial cell surface or that are secreted into the growth medium.
Bacterial PGN hydrolases are cell wall lytic enzymes that comprise a broad and diverse group of proteins. It is often difficult to assign a specific function to a ...
[摘要] 细菌细胞分裂期间细胞表面的代谢涉及细菌细胞壁的主要组分肽聚糖（PGN）的合成和降解。细菌必须确保它们的表面能够承受高的膨胀压力，同时，它们表面的PGN被宿主先天免疫系统产生的受体所掩盖。为了发生细胞分离，并且对于PGN保持隐蔽，“老”PGN由在细菌细胞表面发现或分泌到生长培养基中的特定PGN水解酶（也称为自溶素）降解。
细菌PGN水解酶是包含广泛和多样化蛋白质组的细胞壁溶解酶。主要是因为生物体可以具有大量具有冗余活性的水解酶，并且一种水解酶可以具有多种酶活性并参与各种细胞过程（Vollmer等，2008），通常难以将特定功能分配给PGN水解酶。 。枯草芽孢杆菌35种已知或假设的PGN水解酶，而大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）分别具有约16和19个PGN水解酶（Vollmer，2012; Heidrich等，2001; Singh et al。 ，2012）。
PGN水解酶可分为三大类：糖苷酶，酰胺酶和肽酶。糖苷酶切割聚糖主链，分为N-乙酰氨基葡糖苷酶和N-乙酰神经酰胺酶。酰胺酶切割肽链和聚糖链的N-乙酰神经酰胺残基之间的连接。肽酶，如内肽酶和羧肽酶能够切割PGN干肽的不同氨基酸之间的肽键。
在这里，我们描述了提取与金黄色葡萄球菌细胞壁非共价连接的PGN水解酶的方法（Vollmer，2008）。含有变性PGN水解酶的提取物的分析是通过运行Zymogram凝胶（含有粗细菌细胞壁或底物细胞的SDS-PAGE凝胶）进行的，然后将其在非变性缓冲液中温育以允许PGN水解酶复性。然后可以通过产生在细胞壁消化发生时观察到的清除条带来鉴定这些复性酶。方案分为三个步骤：A）从金黄色葡萄球菌细胞中制备粗自动提取物; ...
|
|
|