| Auxin-mediated Protein Degradation in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] The auxin-inducible degron (AID) technology was recently adapted for use in the nematode Caenorhabditis elegans. Rapid degradation of C. elegans proteins tagged with an AID is mediated by a plant-specific F-box protein, transport inhibitor response 1 (TIR1), and occurs only in the presence of the phytohormone auxin. The first iteration of this technology elicited protein degradation in C. elegans through a naturally occurring form of auxin, indole-3-acetic acid (IAA). Here, we present a protocol that uses 1-naphthaleneacetic acid, potassium salt (K-NAA), an indole-free synthetic auxin analog. At equal concentration, K-NAA is as effective as IAA in standard nematode growth media (NGM). K-NAA is also effective in physiological buffer (M9), allowing for ...
[摘要] [摘要 ] 植物生长素诱导的德隆（AID）技术最近被用于线虫秀丽隐杆线虫。带有AID标签的秀丽隐杆线虫蛋白的快速降解是由植物特异性F-box蛋白介导的，转运抑制剂反应1 （TIR1），而且只发生在存在的植物激素生长素。第一次迭代的这项技术引起蛋白质降解C. 线虫通过一个天然存在形式的生长素，吲哚-3-乙酸（IAA）。在此，我们协议用途1-萘乙酸，钾盐（K-NAA），一个，自由吲哚合成的植物生长素类似物。在相等浓度 ，K-NAA在标准线虫生长培养基（NGM）中与IAA一样有效。K-NAA在生理缓冲液（M9）中也有效，可以进行高通量实验。K-NAA的主要优点有两个：它的光稳定性可防止光诱导的化合物在储存过程中降解以及在活细胞的荧光显微镜检查过程中产生有毒的吲哚衍生物;其次，其水溶性消除了使用乙醇溶解植物生长素化合物（一种可能混淆C 的溶剂）的需要。线虫寿命和行为分析。在这个协议中，我们描述方法降解菌的C. elegans的使用K-NAA对固体和液体介质的蛋白质，以及我们的方法分析蛋白质降解。
[背景 ] 有条件的蛋白质降解通过降解决定子是一个新兴的方法研究蛋白质功能在秀丽隐杆线虫（拔头筹而Frokjaer -詹森2019年）。现在的降解决定子的方法包括ZF1 （Armenti 等人。2014年，萨累。等，2018） ，生长素诱导型德龙（AID）（Zhang ...
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| Single-cell qPCR Assay with Massively Parallel Microfluidic System
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] The single-cell transcriptome is the set of messenger RNA molecules expressed in one cell. It is extremely variable and changes according to external, physical and biochemical conditions. Due to sensitivity shortages, most of genetic studies use bulk samples, providing only the average gene expression. Single-cell technologies have provided a powerful approach to a more detailed understanding of the heterogenic populations and minority cells. However, since it is still a quite novel technique, standardized protocol has to be established. Single-cell qPCR, although partly limited by the number of genes, is relatively simple to analyze. Therefore, its use is accessible without the necessity to recourse to complex bioinformatics analyses. The main steps for single-cell qPCR, as illustrated ...
[摘要] [摘要 ] 单细胞转录组是在一个细胞中表达的信使RNA分子的集合。它变化很大，并会根据外部，物理和生化条件而变化。由于敏感性不足，大多数基因研究使用大量样品，仅提供平均基因表达。单细胞技术提供了一种强大的方法，可以更详细地了解异质群体和少数细胞。然而，因为它仍然是一个相当新的技术，标准化协议具有至b e建立。尽管单细胞qPCR受基因数量的限制，但分析起来相对简单。因此，无需使用复杂的生物信息学分析就可以使用它。如本协议所述，单细胞qPCR的主要步骤包括单细胞分离，细胞裂解液，cDNA逆转录合成，cDNA库生成的扩增以及最终的定量聚合酶链反应。
[背景 ] 的单细胞转录是一套完整的在一个细胞中表达的信使RNA（mRNA）分子。它变化很大，并会根据外部，物理和生化条件而变化。因此，这是生物异质性的来源，其中来自相同环境的细胞与其他细胞相似但不相同。
由于灵敏度不足，大多数遗传研究使用大量样本，其中有数百至数千个细胞，仅提供平均基因表达。这极大地限制了少数细胞群体的研究，这可能会带来特定的特性，例如在癌症情况下的耐药性或转移能力。单细胞技术能够在单细胞水平上分析转录组，从而揭示了异源群体的复杂性。这些技术不仅应用于癌症，而且还应用于许多细胞生物学研究中，包括成年组织，干细胞，免疫细胞等。以及微生物学和病毒学等其他领域（Wen and ...
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| Deoxycholate Fractionation of Fibronectin (FN) and Biotinylation Assay to Measure Recycled FN Fibrils in Epithelial Cells
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Fibronectin (FN) is an extracellular matrix protein that is secreted by many cell types and binds predominantly to the cell surface receptor Integrin α5β1. Integrin α5β1 binding initiates the step-wise assembly of FN into fibrils, a process called fibrillogenesis. We and several others have demonstrated critical effects of fibrillogenesis on cell migration and metastasis. While immunostaining and microscopy methods help visualize FN incorporation into fibrils, with each fibril being at least 3 μm in length, the first study that developed a method to biochemically fractionate FN to quantify fibril incorporated FN was published by Jean Schwarzbauer’s group in 1996. Our protocol was adapted from the original publication, and has been tested on multiple cell types including as shown here in ...
[摘要] 纤连蛋白（FN）是一种细胞外基质蛋白，由许多细胞类型分泌，主要与细胞表面受体整合素α5β1结合。整合素α5β1结合启动FN逐步组装成原纤维，这一过程称为原纤维形成。我们和其他几个人已经证明了原纤维形成对细胞迁移和转移的关键作用。虽然免疫染色和显微镜方法有助于可视化FN掺入原纤维，每个原纤维的长度至少为3μm，但是第一项研究开发了一种生物化学分离FN以量化原纤维并入FN的方法，由Jean Schwarzbauer小组于1996年出版。我们的方案改编自原始出版物，并已在多种细胞类型上进行测试，包括如此处所示的MCF10A乳腺上皮细胞和Caki-1肾癌上皮细胞。使用两种洗涤剂提取物，将细胞FN分离成不溶于洗涤剂或掺入原纤维的FN和可溶性FN或未掺入的级分。为了确定原纤维形成是否利用FN的再循环池，我们使用了生物素标记的FN（FN-生物素）再循环测定，其已经从先前的研究中修改。使用再循环测定和脱氧胆酸盐分离方法的组合，可以定量地证明在不同实验条件下细胞中原纤维形成的程度，并确定原纤维形成的FN来源
【背景】 纤连蛋白（FN）是普遍产生的细胞外基质（ECM）组分（Uitto et al。，1989; Mao和Schwarzbauer，2005）。纤连蛋白库是转录产生的，可以通过几种生长因子如TGF-β1增加（Yokoi et al。，2002; Mimura ...
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