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High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

Nunc TM 15mL&50mL圆锥形无菌聚丙烯离心管

Company: Thermo Fisher Scientific
Catalog#: 339650
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Company-protocol()
Other protocol()

Deoxycholate Fractionation of Fibronectin (FN) and Biotinylation Assay to Measure Recycled FN Fibrils in Epithelial Cells
Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract]  Fibronectin (FN) is an extracellular matrix protein that is secreted by many cell types and binds predominantly to the cell surface receptor Integrin α5β1. Integrin α5β1 binding initiates the step-wise assembly of FN into fibrils, a process called fibrillogenesis. We and several others have demonstrated critical effects of fibrillogenesis on cell migration and metastasis. While immunostaining and microscopy methods help visualize FN incorporation into fibrils, with each fibril being at least 3 μm in length, the first study that developed a method to biochemically fractionate FN to quantify fibril incorporated FN was published by Jean Schwarzbauer’s group in 1996. Our protocol was adapted from the original publication, and has been tested on multiple cell types including as shown here in ... [摘要]  纤连蛋白(FN)是一种细胞外基质蛋白,由许多细胞类型分泌,主要与细胞表面受体整合素α5β1结合。整合素α5β1结合启动FN逐步组装成原纤维,这一过程称为原纤维形成。我们和其他几个人已经证明了原纤维形成对细胞迁移和转移的关键作用。虽然免疫染色和显微镜方法有助于可视化FN掺入原纤维,每个原纤维的长度至少为3μm,但是第一项研究开发了一种生物化学分离FN以量化原纤维并入FN的方法,由Jean Schwarzbauer小组于1996年出版。我们的方案改编自原始出版物,并已在多种细胞类型上进行测试,包括如此处所示的MCF10A乳腺上皮细胞和Caki-1肾癌上皮细胞。使用两种洗涤剂提取物,将细胞FN分离成不溶于洗涤剂或掺入原纤维的FN和可溶性FN或未掺入的级分。为了确定原纤维形成是否利用FN的再循环池,我们使用了生物素标记的FN(FN-生物素)再循环测定,其已经从先前的研究中修改。使用再循环测定和脱氧胆酸盐分离方法的组合,可以定量地证明在不同实验条件下细胞中原纤维形成的程度,并确定原纤维形成的FN来源

【背景】 纤连蛋白(FN)是普遍产生的细胞外基质(ECM)组分(Uitto et al。,1989; Mao和Schwarzbauer,2005)。纤连蛋白库是转录产生的,可以通过几种生长因子如TGF-β1增加(Yokoi et al。,2002; Mimura ...

Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract]  GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide. [摘要]  GTP酶是分子开关,在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换,以及与调节蛋白直接相互作用的重构,为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中,我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基(MANT) - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。

【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,调节细胞过程的广度,从蛋白质生物合成到细胞周期进展,从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关,它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时,GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环(G2结构域)的高度保守苏氨酸和开关II环(G3结构域)的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后,与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化,从而使GTPase变为关闭状态(Vetter and ...

Isolation of Commensal Escherichia coli Strains from Feces of Healthy Laboratory Mice or Rats
Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract]  The colonization abundance of commensal E. coli in the gastrointestinal tract of healthy laboratory mice and rats ranges from 104 to 106 CFU/g feces. Although very well characterized, the family that E. coli belongs to has a very homogeneous 16S rRNA gene sequence, making the identification from 16S rRNA sequencing difficult. This protocol provides a procedure of isolating and identifying commensal E. coli strains from a healthy laboratory mouse or rat feces. The method can be applied to isolate commensal E. coli from other laboratory rodent strains. [摘要]  共生E的殖民丰度。 大肠杆菌在健康实验小鼠和大鼠的胃肠道中的范围为10 4至10 6 CFU / g粪便。 虽然描述得非常好,但那个家族就是这样的。 大肠杆菌属于具有非常均一的16S rRNA基因序列,使得从16S rRNA测序鉴定困难。 该协议提供了分离和识别共生E的程序。 来自健康实验室小鼠或大鼠粪便的大肠杆菌菌株。 该方法可以应用于隔离共生电子。 来自其他实验室啮齿类动物的大肠杆菌。

【背景】大肠杆菌是革兰氏阴性兼性厌氧菌,其仅构成脊椎动物肠道微生物群的一小部分,但在微生物相互作用,免疫调节和代谢功能中起关键作用(Tenaillon等人。,2010)。作为最好的模式微生物之一,共生E。已经越来越多地研究大肠杆菌菌株以揭示肠道共生微生物适应独特生态位并影响宿主生理机制。然而,不同菌株之间的高度同源性在共生E的鉴定和表征上提出了困难。基于16S rRNA测序方法的大肠杆菌。由于新一代测序技术的发展和全基因组的大规模分析,我们能够识别共生E。根据基因组中毒力基因的存在,分离自不同宿主的胃肠道的大肠杆菌菌株。在这个协议中,我们展示了一种分离和识别共生E的方法。使用选择性培养基和全基因组测序从实验室小鼠或大鼠获得大肠杆菌菌株。但是,应该指出的是,共生E的存在。大肠杆菌在实验室动物中取决于设施的供应商和环境条件。

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