| Preparation of Cell-free Synthesized Proteins Selectively Double Labeled for Single-molecule FRET Studies
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Single-molecule FRET (smFRET) is a powerful tool to investigate molecular structures and conformational changes of biological molecules. The technique requires protein samples that are site-specifically equipped with a pair of donor and acceptor fluorophores. Here, we present a detailed protocol for preparing double-labeled proteins for smFRET studies. The protocol describes two cell-free approaches to achieve a selective label scheme that allows the highest possible accuracy in inter‐dye distance determination.
[摘要] 单分子FRET（smFRET）是研究生物分子的分子结构和构象变化的有力工具。 该技术需要蛋白质样品，该样品是特定位点配有一对供体和受体荧光团的。 在这里，我们提供了一个制备smFRET研究的双标记蛋白的详细方案。 该协议描述了两种无细胞方法来实现选择性标记方案，其允许在染料间距离确定中具有最高可能的准确性。
【背景】单分子FRET（smFRET）是结构生物学中最重要的工具之一，特别是用于分析蛋白质的结构和功能构象变化（Michalet等人，2006; Roy等人。，2008; Sustarsic和Kapanidis，2015）。然而，smFRET的广泛应用在许多情况下受限于合适的蛋白质样品的精细生产。这些蛋白质需要配备两个荧光团，位点特异性连接在蛋白质结构内的不同位置。
经典的基于细胞的蛋白质生产需要一系列耗时的步骤，可以通过使用无细胞蛋白质合成（CFPS）系统来克服，允许更快且直接地生产和选择适当的双标记蛋白质。此外，CFPS的另一个优点是由于几类蛋白质如蛋白酶或膜蛋白对活细胞或其他原因有毒，难以在细胞中表达，可以在CFPS系统中成功合成。最后，CFPS是专注于光谱技术如smFRET的实验室的理想工具，因为细胞培养不是必需的，并且不必考虑重组生物的安全规定。
尽管smFRET所需的样本量本质上很低，但迄今为止，在smFRET研究中，CFPS尚未被标准地用于生产样本。这主要是由于与基于细胞的系统相比蛋白质产量低得多，并且缺乏适当的无细胞方法，其允许适当量的双标记蛋白质的方便合成。然而，正如我们的小组所表明的那样，得益于更高效的正交标记方案（Sadoine ...
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| In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样（Ubl）蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程，重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素（Ub）与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化，其控制真核细胞中大量的细胞过程（Glickman和Ciechanover，2002; Komander和Rape，2012）。遍在蛋白化由一系列酶（包括Ub激活酶（E1），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s））催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法（Zhao等人，2012）。在古细菌中，Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠，并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow，（2014）综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在，但基于一级序列比较，在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是Ubl蛋白质修饰（sampylation）与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< （体外）（fu="">
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| Extraction of Intracellular and Cell Wall Proteins from Leaves and Roots of Harsh Hakea
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Author:
Date:
2015-12-05
[Abstract] Plant proteins can be targeted to intracellular (i.e., cytosol, vacuole, organelles etc.) or extracellular (i.e., cell walls, apoplast) compartments. Dual targeting is a key mechanism with important implications for plant metabolism, growth, development and defense etc. Harsh Hakea (Hakea prostrata R.Br.) is a perennial species and member of the Proteaceae family that thrives on extremely phosphate impoverished soils of southwestern Australia. Harsh Hakea is not a common model organism, but has been widely developed for physiological and molecular/biochemical studies of the endogenous adaptations of an ‘extremophile’ plant species to abiotic stress, including low phosphorus tolerance. Tissues of Harsh Hakea contain large amounts of compounds (e.g. ...
[摘要] 植物蛋白可以靶向细胞内（即胞质溶胶，液泡，细胞器等）或细胞外（即细胞壁，质外体）区室。双重靶向是对植物新陈代谢，生长，发育和防御等具有重要影响的关键机制。 Harsh Hakea（ Hakea prostrata R.Br.）是一种多年生物种和成员的泛革兰科家族，在澳大利亚西南部的极端磷酸盐贫困土壤上生长。 Harsh Hakea不是一种常见的模式生物，而是广泛开发用于"极端"植物物种对非生物胁迫（包括低磷耐性）的内源性适应的生理学和分子/生物化学研究。 Harsh Hakea的组织含有大量干扰可溶性蛋白质提取的化合物（例如，酚类化合物）。我们以前优化了来自Harsh Hakea蛋白质组织根的细胞内蛋白质的提取，将可溶性蛋白质产量提高至少10倍（Shane等人，2013）。在这里，我们描述的提取和细胞内分离从"松散绑定"细胞壁蛋白质在Harsh Hakea的协议。
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