| In vitro Autophosphorylation and Phosphotransfer Assay of Cyanobacterial Histidine Kinase 2
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] This is a detailed protocol of an autophosphorylation and phosphotransfer activities of Synechocystis sp. PCC 6803 full-length Histidine Kinase 2 (Hik2) protein described by Ibrahim et al., 2016. In this protocol, radioactively labelled ATP was used to study an autophosphorylation and phosphotransfer activity of the full-length Hik2 protein.
[摘要] 这是集胞藻的自磷酸化和磷酸转移活性的详细方案。在该方案中，使用放射性标记的ATP来研究全长Hik2的自磷酸化和磷酸转移活性，所述磷酸转移活性是由Ibrahim等人在2016年描述的。蛋白。
关键字：组氨酸激酶2，自身磷酸化，磷酸转移，Rre1，RppA，集胞藻。 PCC 6803
[背景] 蛋白磷酸化是发生在每个活生物体中的蛋白质的重要翻译后修饰。蛋白激酶（催化蛋白质磷酸化的酶）的活性首先由Burnett和Kennedy在1954年描述，其中它们通过肝酶显示酪蛋白的磷酸化（Burnett和Kennedy，1954）。然而，它的意义直到20世纪70年代和80年代才被欣赏（Cohen，2002）。可以使用偶联测定或直接用放射性标记的ATP研究磷酸γ-磷酸从ATP分子转移到蛋白质。基于掺入32 ...
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| 3’ Rapid Amplification of cDNA Ends (3’ RACE) Using Arabidopsis Samples
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Author:
Date:
2015-10-05
[Abstract] Production of functional eukaryotic RNA is a very elaborate process that involves a complex interplay between transcription and various RNA processing activities, including splicing, 5’ capping, and 3’ cleavage and polyadenylation (Bentley, 2014). Accurate mapping of RNA ends provides a valuable tool to assess transcriptional and post-transcriptional events giving rise to different gene transcripts. The abundance of such transcripts most likely depends on exogenous and developmental cues, or mutations. In the reference plant Arabidopsis, perturbation of the HUA-PEP post-transcriptional regulatory factors (Rodríguez-Cazorla et al., 2015) leads to the accumulation of aberrant transcripts of the key floral homeotic gene AGAMOUS (AG) (Yanofsky et ...
[摘要] 功能真核RNA的生产是非常复杂的过程，其涉及转录和各种RNA加工活性（包括剪接，5'加帽和3'剪切和聚腺苷酸化）之间的复杂相互作用（Bentley，2014）。 RNA末端的精确作图提供了评估产生不同基因转录物的转录和转录后事件的有价值的工具。这种转录物的丰度最可能取决于外源和发育线索或突变。在参考植物拟南芥中，HUA-PEP 转录后调节因子（Rodríguez-Cazorla等人，2015）的扰动导致保留内含子序列的关键花卉同源异源基因（AGO）（ ）（Yanofsky等人，1990）的异常转录物的积累。通过3'RACE反应测定，这样的错误转录物对应于在AG 内含子区发生的过早加工和聚腺苷酸化事件。在这里我们描述了一个适用于分析相对丰富的转录物以及用于检测可能易于快速更新的异常RNA种类的方案。同样地，此处适于拟南芥生殖组织的方法可用于表征来自其他器官（叶，根）和/或其它植物物种的RNA种类。我们提供我们的3'RACE程序的详细方案，包括四个主要部分：总RNA提取，RNA量测定和质量控制，RACE程序本身，和分离所得RACE产物用于克隆和测序。
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| Purification and Sequencing of DNA Guides from Prokaryotic Argonaute
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Author:
Date:
2014-11-20
[Abstract] Some proteins utilize nucleic acids to guide them to complementary nucleic acid targets. One example is prokaryotic Argonaute protein, which, binds small single stranded DNA molecules as guides (Swarts et al., 2014). This protocol describes a method to purify DNA guides from these proteins. It also describes a PCR-based method to enrich the guides by PCR amplification. This methods relies on addition of a poly-A tail at the 3’-end of the ssDNA molecules by Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), followed by ligation of a oligonucleotide to the 5’-end of the ssDNA molecule using T4 RNA ligase, and amplification by PCR. The generated dsDNA products are suitable for traditional cloning and sequencing and high-throughput sequencing. Importantly, the information which strand ...
[摘要] 一些蛋白利用核酸来将它们引导至互补核酸靶。 一个实例是原核Argonaute蛋白，其结合小的单链DNA分子作为指导（Swarts等人，2014）。 该协议描述了从这些蛋白质中纯化DNA指南的方法。 它还描述了基于PCR的方法以通过PCR扩增来富集指南。 该方法依赖于通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在ssDNA分子的3'末端添加聚腺苷酸尾，然后使用T4 RNA连接酶将寡核苷酸连接到ssDNA分子的5'末端， 和通过PCR扩增。 所产生的dsDNA产物适合于传统的克隆和测序以及高通量测序。 重要的是，与ssDNA分子匹配的链的信息在该过程中不会丢失。
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