| Affinity Purification of GO-Matryoshka Biosensors from E. coli for Quantitative Ratiometric Fluorescence Analyses
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Author:
Date:
2020-10-05
[Abstract] Genetically encoded biosensors are powerful tools for quantitative visualization of ions and metabolites in vivo. Design and optimization of such biosensors typically require analyses of large numbers of variants. Sensor properties determined in vitro such as substrate specificity, affinity, response range, dynamic range, and signal-to-noise ratio are important for evaluating in vivo data. This protocol provides a robust methodology for in vitro binding assays of newly designed sensors. Here we present a detailed protocol for purification and in vitro characterization of genetically encoded sensors, exemplified for the His affinity-tagged GO-(Green-Orange) MatryoshCaMP6s calcium sensor. GO-Matryoshka sensors are based on single-step insertion ...
[摘要] [摘要]遗传编码的生物传感器是强大的工具为离子和代谢物的定量可视化在体内。设计和优化此类生物传感器通常需要分析大量变体。体外确定的传感器特性，例如底物特异性，亲和力，响应范围，动态范围和信噪比，对于评估体内数据很重要。该协议为新设计的传感器的体外结合测定提供了可靠的方法。这里我们提出了一个详细的协议用于纯化和体外表征的遗传编码的传感器，例示的His亲和标记的GO-（绿橙色）MatryoshCaMP6s钙传感器。GO-Matryoshka传感器基于在感兴趣的结合蛋白内一步插入一个包含两个嵌套荧光蛋白，圆形排列的荧光绿色FP（cpGFP ）和Large Stoke Shift LSSmOrange的盒的方法，从而产生了利用被分析物触发的比例式传感器cpGFP的荧光变化。
[背景技术]将绿色荧光蛋白（GFP）在1962年被鉴定在水母水母维多利亚（下村等人，1962） 。30年后，描述了其首次用作报道基因（Chalfie等，1994）。自从发现以来，GFP变体和其他荧光蛋白为生物科学的主要进步做出了巨大贡献，并且现在已成为生物医学研究中的常用工具（Frommer等，2009）。
各种荧光蛋白（FP）和FP变异体已被用作报道分子或与所有生命王国的生物体中的蛋白融合（Chudakov等，2010 ；Valeur和Berberan- ...
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| In vitro Real-time Measurement of the Intra-bacterial Redox Potential
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Author:
Date:
2015-09-05
[Abstract] All bacteria that live in oxygenated environments have to deal with oxidative stress caused by some form of exogenous or endogenous reactive oxygen species (ROS) (Imlay, 2013). Large quantities of ROS damage DNA, lipids and proteins which can eventually lead to bacterial cell death (Imlay, 2013). In contrast, smaller quantities of ROS can play more sophisticated roles in cellular signalling pathways affecting almost every process in the bacterial cell e.g. metabolism, stress responses, transcription, protein synthesis, etc. Previously, inadequate analytical methods prevented appropriate analysis of the intra-bacterial redox potential. Herein, we describe a method for the measurement of real-time changes to the intra-bacterial redox potential using redox-sensitive GFP ...
[摘要] 所有存在氧合环境中的细菌都必须处理由某种形式的外源性或内源性活性氧（ROS）引起的氧化应激（Imlay，2013）。大量的ROS损伤DNA，脂质和蛋白质，其可以最终导致细菌细胞死亡（Imlay，2013）。相反，较少量的ROS可以在细胞信号传导途径中发挥更复杂的作用，影响几乎细菌细胞中的每一个过程，例如，代谢，应激反应，转录，蛋白质合成等 。以前，不充分的分析方法阻止了细菌内氧化还原电位的适当分析。在本文中，我们描述了使用氧化还原敏感性GFP（roGFP2）测量细菌内氧化还原电位的实时变化的方法（van der Heijden等人，2015）。 roGFP2蛋白被工程改造成含有特定的半胱氨酸残基，其在氧化时形成内部二硫键，导致蛋白构象的轻微改变（Hanson等人，2004）。这种移位导致两种不同的蛋白质同种型在分别在405nm和480nm下激发后具有不同的荧光激发光谱。因此，相应的405/480nm比率可以用作细菌内氧化还原电位的量度。比率量度分析排除了由于roGFP2浓度差异引起的变化，并且由于构象变化是可逆的，因此系统允许测量氧化以及还原条件。在该方案中，我们通过测量鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌）内的细菌内氧化还原电位来描述该系统，但该系统可以调整用于其他革兰氏阴性菌。
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