| Identification of Buffer Conditions for Optimal Thermostability and Solubility of Herpesviral Protein UL37 Using the Thermofluor Assay
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Structural and biochemical studies of proteins require high amounts of stable, purified proteins. Protein stability often depends on the buffer composition, which includes pH and concentration of salts or other solutes such as glycerol, hence an efficient method for identifying optimal buffer conditions for stability would minimize time and resources used for protein purification and further studies. This protocol describes the use of the Thermofluor assay, in combination with a custom 24-condition screen, to identify buffer conditions that increase protein thermostability, using the conserved herpesviral protein UL37 as an example. Detailed instructions on screen conditions, running the Thermofluor MATLAB script, and analyzing the data are provided. In comparison to circular dichroism ...
[摘要] [摘要]蛋白质的结构和生化研究需要大量稳定、纯化的蛋白质。蛋白质的稳定性通常取决于缓冲液的组成，其中包括pH值和盐或其他溶质（如甘油）的浓度，因此，确定最佳缓冲液稳定性条件的有效方法可以将用于蛋白质纯化和进一步研究的时间和资源减至最少。本协议描述了使用热氟分析，结合自定义的24条件筛选，以确定缓冲条件，增加蛋白质热稳定性，使用保存的疱疹病毒蛋白UL37为例。详细说明了屏幕条件，运行Thermofluor的MATLAB脚本，并对数据进行了分析。与圆二色谱法（CD）相比，缓冲屏结合热荧光分析法为蛋白质热稳定性分析提供了一种快速、信息量大的方法。
[背景]蛋白UL37在疱疹病毒的生命周期中具有多种功能，是高效病毒复制所必需的。作为病毒膜的一个组成部分——夹在包含衣壳和脂质膜的基因组之间的一层——UL37不仅是病毒组装所必需的（Desai等人，2001年；Jambunathan等人，2014年），而且也是有效的衣壳运输（Leege等人，2009年）、神经入侵（Richards等人，2017年）和对抗宿主天然免疫应答（Liu等人，2008；Zhao等人，2016）。要更好地理解其多功能性的本质，就需要对其结构和生化特性有详细的了解，而这又需要性能良好的纯化蛋白质。
不同UL37结构体的初始制备在溶解度、单分散性和纯化蛋白的产率方面存在差异，使得蛋白制备不一致，进一步的表征也不可重现。由于缓冲优化是解决这些问题的直接方法，我们开发了一种24条件筛选法，可以改变缓冲剂、pH值以及NaCl和甘油的浓度，并将其与热氟分析法结合使用（Phillips等人，2011年），以确定最大限度提高热稳定性的缓冲条件。UL37的N端和C端具有可变的平均热稳定性和最佳缓冲条件（图1，表1）。然而，在所有情况下，提高蛋白质稳定性的条件也提高了蛋白质的溶解度，最终提高了纯化蛋白质的产量，从而促进了下游的生化特性。 ...
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| MAMP-triggered Medium Alkalinization of Plant Cell Cultures
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Plants recognize a wide variety of microbial molecules to detect and respond to potential invaders. Recognition of Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs) by cell surface receptors initiate a cascade of biochemical responses that include, among others, ion fluxes across the plasma membrane. A consequence of such event is a decrease in the concentration of extracellular H+ ions, which can be experimentally detected in plant cell suspensions as a shift in the pH of the medium. Thus, similarly to reactive oxygen species (ROS) accumulation, phosphorylation of MAP kinases and induction of defense-related genes, MAMP-induced medium alkalinization can be used as a proxy for the activation of plant immune responses. Here, we describe a detailed protocol for the measurement of ...
[摘要] [摘要 ] 植物识别多种微生物分子以检测和响应潜在的入侵者，通过细胞表面受体识别微生物相关的分子模式（MAMP）引发一系列生化反应，其中包括跨血浆的离子通量此类事件的后果是细胞外H + 离子浓度降低，这可以通过实验检测到植物细胞悬浮液中培养基pH值的变化，因此类似于活性氧（ROS）积累， MAP激酶的磷酸化和防御相关基因的诱导，MAMP诱导的培养基碱化可以用作激活植物免疫反应的代理。在这里，我们描述了测量烟草BY-2细胞培养基碱化的详细方案两种不同MAMP处理后的悬浮液：衍生自真菌细胞壁的壳六聚体（NAG6； N-乙酰氨基葡萄糖）和鞭毛蛋白表位flg22 ，在细菌鞭毛发现。氏S分析提供了可靠和快速的平台来访问毫安时触发免疫（在MTI）在烟草悬浮细胞，并且可以很容易地适应其他植物物种以及其他毫安。
[背景 ] 在整个进化过程中，植物都具有检测微生物衍生分子并建立起能够抓住有害相互作用的免疫反应的能力（Boutrot和Zipfel，2017年）。诱导此类免疫反应的微生物相关分子模式（MAMP）通常被广泛保存。微生物的结构成分，例如真菌的几丁质和细菌的鞭毛蛋白（Cook 等人，2015）。胞外植物受体对MAMP的识别会导致MAMP触发的免疫（MTI），从而阻止微生物入侵并维持植物健康。（Böhmet al。，2014）。
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| In vitro Conditions for Dark Growth and Analysis of Maize Seedlings
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] Maize is an important model organism for understanding plant traits essential for proper growth and germination. One type of growth, skotomorphogenesis, occurs in the absence of light. Seedlings grown in the absence of light exhibit dramatic differences in stem and leaf development compared to light-grown plants. Dark-growth conditions require the use of highly controlled plant growth environments. Here, we provide step-by-step instructions for creating a soilless and dark plant growth environment for maize using half-strength Murashige and Skoog media solidified with agar in clear boxes that are covered in aluminum foil. The benefits of this protocol are that it does not require special dark-growth conditions and the growth media can be easily and uniformly supplemented with hormones or ...
[摘要] [摘要] 玉米为理解植物性状进行适当的生长和发芽所必需的重要的模式生物。一种生长类型，变态发生，发生在没有光照的情况下。与光照生长的植物相比，在没有光照的情况下生长的幼苗在茎和叶的发育上表现出巨大的差异。黑暗生长条件要求使用高度受控的植物生长环境。在这里，我们提供使用半强度Murashige 来为玉米创建无土和深色植物生长环境的分步说明 和Skoog培养基在透明的盒子中用琼脂固化，并用铝箔覆盖。该协议的好处在于它不需要特殊的黑暗生长条件，并且可以轻松，均匀地向生长培养基中补充激素或其他化学物质。
[背景] 无土培养基和温度受控的环境已经使用了八十多年，以产生可再生的植物生长（McClary，1940； George 等，2008）。的Murashige 和Skoog（MS）培养基，含有盐，氨基酸和维生素，是最常用的植物生长中的一个媒体（的Murashige 和Skoog，1962）。MS最初是为烟草开发的，但此后已用于种植其他植物，包括 拟南芥和玉米。与其他无土培养基（例如泥炭，珍珠岩和ver石）不同，这种生长培养基不易与植物激素反应（Best 等，2014和2017； Malik 等，2014）。因此，可以将激素添加到生长培养基中，以比较野生型和突变型生长之间的反应。
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