| Dot Blot Analysis of N6-methyladenosine RNA Modification Levels
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] N6-methyladenosine (m6A) is the most prevalent internal modification of eukaryotic messenger RNA (mRNA). The total amount of m6A can be detected by several methods, such as dot blot analysis using specific m6A antibodies and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (Fu et al., 2014; Shen et al., 2016). Here we describe the method for fast detection of total m6A levels in mRNA by dot blot analysis using a specific m6A antibody.
[摘要] N 6 - 甲基腺苷（m 6）是真核信使RNA（mRNA）的最普遍的内部修饰。可以通过几种方法检测m 6的总量，例如使用特异性m 5抗体的斑点印迹分析和定量液相色谱 - 串联质谱（LC- MS / MS）（Fu等人，2014; Shen等人，2016）。在这里，我们描述使用特异性m 5抗体通过斑点印迹分析来快速检测mRNA中的总m 6 A水平的方法。
背景 与其他方法（如二维薄层色谱和LC-MS / MS）相比，mRNA检测的斑点印迹分析相对容易，快速，经济有效。这种方法可以以定性的方式用于评估在不同发育阶段的各种植物组织或植物中的m A水平的时间和空间变化。这对于通过其他复杂和定量方法进行详细调查之前初步检查相关突变体中m A水平的变化特别有用。
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| A Ribosome Footprinting Protocol for Plants
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Ribosome footprinting, or Ribo-seq, has revolutionized the studies of translation. It was originally developed for yeast and mammalian cells in culture (Ingolia et al., 2009). Herein, we describe a plant-optimized hands-on ribosome footprinting protocol derived from previously published procedures of polysome isolation (Ingolia et al., 2009; Mustroph et al., 2009) and ribosome footprinting (Ingolia et al., 2009; Ingolia et al., 2013). With this protocol, we have been able to successfully isolate and analyze high-quality ribosomal footprints from different stages of in vitro grown Arabidopsis thaliana plants (dark-grown seedlings [Merchante et al., 2015] and 13-day-old plantlets in plates and plants grown in liquid ...
[摘要] 核糖体足迹或Ribo-seq，彻底改变了翻译研究。它最初是为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的（Ingolia等人，2009）。本文中，我们描述了来自先前公开的多核糖体分离程序的植物优化的亲手核糖体印迹方案（Ingolia等人，2009; Mustroph等人，2009 ）和核糖体印迹（Ingolia等人，2009; Ingolia等人，2013）。使用该协议，我们能够成功地分离和分析来自体外生长的拟南芥植物（黑暗生长的幼苗）的不同阶段的高质量核糖体印迹[Merchante < ，以及在液体培养物中生长的板和植物中的13天龄小植物[未发表的结果]）。
[背景] 翻译在调节基因活性中的中心作用早已被公认，但是在响应于特定刺激的全基因组翻译定量变化的系统探索最近才变得技术上可行。最初为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的核糖体印迹技术（通常称为Ribo-seq）已经彻底改变了翻译调节和基因表达的研究，因为其允许确定核糖体在基因组 - ...
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| Circular RT-PCR Assay Using Arabidopsis Samples
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Author:
Date:
2015-07-20
[Abstract] Post-transcriptional processing is critical for RNA biogenesis, in which conventional functional RNA transcripts are generated, such as messenger RNAs (mRNAs), transfer RNAs (tRNAs) and ribosomal RNAs (rRNAs) for translation as well as emerging non-coding RNAs with known or unknown regulatory functions. To determine the precise termini of an RNA molecule during or after processing, the primer extension and Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) methods have been routinely utilized for the precise mapping of 5’ or 3’ ends. Different from these assays, which are designed to detect only one end of a specific target RNA at a time, circular Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (cRT-PCR) is able to simultaneously determine both the 5’ and 3’ ends of the target RNA. In Arabidopsis ...
[摘要] 转录后加工对于RNA生物发生至关重要，其中产生常规功能性RNA转录物，例如用于翻译的信使RNA（mRNA），转移RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）以及已知的新编码RNA或未知的调节功能。为了在加工期间或之后确定RNA分子的精确末端，引物延伸和cDNA末端的快速扩增（RACE）方法已经常规地用于5'或3'末端的精确作图。与设计为一次仅检测特定靶RNA的一端的这些测定法不同，环状逆转录 - 聚合酶链式反应（cRT-PCR）能够同时测定靶标的5'和3'末端RNA。在拟南芥中，cRT-PCR已经被广泛应用于鉴定核糖体RNA前体的5'和3'末端，或者评估在3'末端的长度或转录后延伸成熟mRNA。在该方案中，我们总结并提出了在拟南芥中cRT-PCR测定的详细程序，其也成功地用于我们以前公开的工作中（Hang等人 ，2014）。
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